Эффективность методов молекулярного маркирования в селекции, семеноводстве сельскохозяйственных культур и для изучения биоразнообразия растительных ресурсов - Автореферат (Мухина Ж.М.)

Содержание работы

 

1          ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В главе анализируется современное состояние проблемы, связанной с применением молекулярно-генетических маркеров в практической селекции и семеноводстве сельскохозяйственных растений, а также для изучения биораз- нообразия растительных ресурсов. Выполнена подборка и краткое описание ре- зультатов отечественных и зарубежных исследований, касающихся указанной тематики.

2          МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

 

Исследования проводились с 2000 по 2011 гг. в ГНУ ВНИИ риса (г. Крас- нодар); часть полевых экспериментов – во ВНИИ зерновых культур им. И.Г. Калиненко (г. Зерноград, Ростовская область); работы, связанные с выделением ДНК грибных фитопатогенов – во ВНИИФ (п. Большие Вяземы, Московская обл.).

В программе интрогрессии генов широкого спектра устойчивости риса к пирикуляриозу Рi-1, Рi-2, Рi-33 в отечественные сорта риса в качестве доноров этих генов были использованы линии риса C104-Lac, C101-A-51, C101-Lac (подвид indica), которые несут гены Pi-1, Pi-2, Pi-1+Pi-33, соответственно (рабо- чая коллекция ВНИИ риса). Российские сорта риса Виктория, Вираж и Боярин (подвид japonica) использовали как реципиентные родительские формы (кол- лекция лаборатории селекции, семеноводства и технологии возделывания риса ВНИИ зерновых культур им. И.Г. Калиненко, г. Зерноград).

Проверку эффективности созданного в рамках исследования ДНК-марке- ра гена устойчивости к пирикуляриозу риса Pi-ta проводили на сортах риса К1 (положительный контроль); Nipponbare (отрицательный контроль); а также – сортах Виктория; IR36; Toride; Ou 244 (рабочая коллекция ВНИИ риса). Поиск доноров указанного гена с применением созданного ДНК-маркера проводили на 103 сортообразцах, отобранных для контрольного питомника ВНИИ риса в

2009 году, а также на растениях 33-х F7-линий от скрещивания сортов IR-58 x Кубань 3 (коллекция лаборатории селекции, семеноводства и технологии возде- лывания риса ВНИИ зерновых культур им. И.Г. Калиненко).

Проверку эффективности созданного ДНК-маркера гена Rc риса проводи- ли на контрастных по изучаемому признаку сортах риса: краснозёрных – Ру- бин, Карат; белозёрных – Хазар, Талисман, Снежинка; а также на белозёрных сортах и их краснозёрных аналогах – Павловский, Спринт, Виктория, Соната, Привольный, Кубань-3 (рабочая коллекция ВНИИ риса). Полевую апробацию маркера проводили на сортах риса Атлант, Ренар, Флагман, выращиваемых в питомнике испытания потомств первого года (ПИП1) лаборатории семено- водства и семеноведения ВНИИ риса.

Изучение генетической основы феномена краснозерных аналогов бело- зерных сортов в системе семеноводства риса проводили молекулярным (микро- сателлитным) анализом на белозерных сортах Бластоник, Виктория, Изумруд, Краснодарский-86, Кубань-3, Лиман, Павловский, Привольный, Соната, Спринт и их краснозёрных аналогах.

Генетическую  паспортизацию  отечественных  сортов  и  сортообразцов риса проводили ДНК (микросателлитным) анализом; в качестве материала ис- пользовали 39 сортов и сортообразцов рабочей коллекции ВНИИ риса.

Оценку генетической однородности гибридных семян подсолнечника (Helianthus annuus L.) методом маркирования микросателлитных локусов ДНК проводили на трех простых гибридах посеменным анализом (оригинатор гибри- дов – компания «Агроплазма», г. Краснодар). Для анализа использовали по 100 семянок каждой изучаемой партии гибридов.

Изучение биоразнообразия образцов российской государственной коллек- ции Magnoporthe grisea (Herbert) Barr – возбудителя пирикуляриоза риса – на основе молекулярно-генетического подхода проводили с использованием ДНК

59-ти коллекционных штаммов патогена (Российская государственная коллек- ция  патогена;  отдел  микологии  и  иммунитета  ВНИИ  фитопатологии,  п. Большие Вяземы, Московская область).

Изучение меж- и внутривидового разнообразия сорных растений рода Echinochloa  на  основе  изучения  полиморфизма  микросателлитных  локусов ДНК проводили с использованием 80 гербарных образцов, собранных в разных зонах рисосеяния стран СНГ.

Экстракцию ДНК из растительного материала проводили СТАВ-методом (Murray M.G.,Thompson W.F., 1980), а также методом Kang H.W. (1998). Кон- центрацию выделенной ДНК определяли спектрофотометрически по стандарт- ной методике (Маниатис T. и др., 1984), а также по интенсивности окрашива- ния ДНК бромистым этидием в агарозном геле (Остерман Л.А., 1981).

Праймеры,  использованные  в  исследованиях,  синтезированы  фирмой

ЗАО «Синтол» (г. Москва). ДНК-амплификацию проводили на амплификаторе

«Терцик» («ДНК-технология», г. Москва). Условия проведения амплификации были индивидуальны для каждого праймера. В большинстве случаев проводили их оптимизацию.

Контроль донорных аллелей генов широкого спектра устойчивости риса к пирикуляриозу Pi-1, Pi-2, Pi-33 в программе насыщающих скрещиваний прово- дился микросателлитными маркерами, тесно сцепленными с целевыми генами: Rm 527, SSR 140 – для гена Pi-2; Rm 224 – для гена Pi-1; Rm 72, Rm 310 – для гена Pi-33. Сиквенс праймерных пар указанных микросателлитных маркеров

доступен        в          открытой        базе     генетических данных           GenBank

(https://www.ncbi.nlm.nih.gov).

Генетическую  паспортизацию  отечественных  сортов  и  сортообразцов риса проводили с использованием 14 ПЦР (микросателлитных) маркеров (https://www.ncbi.nlm.nih.gov).

Для изучения генетического сходства белозерных сортов риса с их крас- нозерными аналогами попарно сравнивали аллельное разнообразие 30 микроса- теллитных локусов ДНК (https://www.gramene.org).

Для оценки генетической однородности партий гибридных семян изучае- мых гибридов подсолнечника (Helianthus annuus L.) были использованы микро- сателлитные маркеры: Ha 514-ar; Ha 1287-ar; Ha 1442-ar; Ha 1608-ar; Ha 1796-ar; HA 1327-ar (https://www.ncbi.nlm.nih.gov).

Для проведения ДНК (микросателлитного) анализа растений рода Echinochloa использовали микросателлитные маркеры: ЕС1, ЕС2, ЕС3, ЕС5 (Danquah E.Y. et al., 2002).

Для генотипирования 59 образцов российской государственной коллек- ции Magnoporthe grisea (Herbert) Barr (возбудителя пирикуляриоза риса) изуча- ли полиморфизм 21 микросателлитного локуса паразита (https://www.ncbi.nlm.nih.gov).

В большинстве экспериментов ПЦР проводили с 40-50 нг ДНК в конеч- ном объеме 25 мкл. Использовали следующий состав реакционной смеси:

0,1 mM каждого дезоксирибонуклеозидфосфата; 0,23  М каждого прайме- ра; 1 х ПЦР буфер (20 mM Трис-HCL, pH 8,4; 50 мМ KCL); 1 единица Taq-по- лимеразы.

Изначально температуру отжига праймеров рассчитывали по формуле Di-

effenbach C.W. et al. (1995):

Т=4 оС×(G+C)+2 оС×(А+Т)–3, где G, C, A, T – количество гуанидиновых, цитозиновых, адениновых и тиминовых оснований, соответственно. В дальней- шем ее корректировали (уменьшали или увеличивали) для каждой праймерной пары в зависимости от качества ПЦР-продукта, получаемого при рассчитанной температуре. Таким образом, экспериментально были подобраны оптимальные условия ПЦР, обеспечивающие высокий выход продукта амплификации наряду с минимальным количеством синтезированных неспецифичных фрагментов ДНК.

Для электрофоретического разделения продуктов ПЦР большинства изу- ченных и созданных в рамках данного исследования маркеров использовали 8\% полиакриламидный гель на основе 1×Трис-боратного буфера (0,09 М Трис, 0,09

М борной кислоты, 2 мМ ЭДТА, рН=8,2). Визуализацию проводили в ультра-

фиолете после окрашивания гелей бромистым этидием (EtBr). Идентификацию и размер аллелей определяли с использованием программы GelPro 32.

Гибридизацию растений риса проводили пневмокастрацией и опылением

«твелл» – методом (Лось Г.Д., 1987).

Oценку устойчивости растений риса к пирикуляриозу проводили в усло- виях вегетационной площадки ВНИИ риса в соответствии с методическими указаниями (Коваленко Е.Д., Горбунова Ю.В., Ковалева А.А. и др., 1988).

Для статистического анализа экспериментальных данных использовали кластерный (Ward J.H., 1963) и дискриминантный анализы (Клекка У.Р., 1989).

 

3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Интрогрессия генов широкого спектра устойчивости к пирикуля- риозу Рi-1, Pi-2, Pi-33 в отечественные сорта риса с применением методов маркерной селекции

Гены широкого спектра устойчивости риса к пирикуляриозу, Рi-1, Рi-2, Рi-33, являются важным генетическим ресурсом для селекции. (Deng Y. еt al.,

2006). Многочисленные исследования показывают, что наибольший эффект перечисленные гены проявляют при совместном действии (Girish Kumar K. et al., 2000; Correa-Victoria F.J. et al., 2003).

В этой связи для придания длительной устойчивости к заболеванию нами проводилось пирамидирование указанных генов на генетической основе отече- ственных сортов риса Вираж, Боярин, Виктория.

На рисунке 1 представлена схема переноса каждого из генов Рi-1, Pi-2, Pi-

33 в генотипы указанных сортов риса из линий-доноров.

Из рисунка видно, что, уже начиная с первого возвратного скрещивания, все последующие этапы селекционной схемы сопровождались маркерным контролем  присутствия  переносимых  донорных  аллелей  в  гибридном потомстве. Причем, поскольку оценка потомства по фенотипу (фитопатологи- ческий тест) не велась, ввиду отсутствия совместимых рас паразита, контроль передачи потомству соответствующего аллеля устойчивости на всех этапах се- лекционной схемы осуществлялся исключительно молекулярно-генетическим методом (микросателлитный анализ). Это стало возможным ввиду тесного сцепления использованных микросателлитных локусов с целевыми генами устойчивости, обеспечивающим их сонаследование.

После первого самоопыления проводился, кроме того, индивидуальный отбор (рис.1). Отбирали растения, наиболее близкие по морфотипу к реципи - ентной родительской форме и несущие, кроме того, донорные гены устойчиво- сти к патогену в гомозиготном доминантном состоянии.

 

 

Рисунок 1 – Схема интрогрессии каждого из генов устойчивости к пирикуляри- озу Рi-1, Pi-2, Pi-33 в отечественные сорта риса

 

Рисунок 2 иллюстрирует маркерный контроль переносимой донорной ал- лели гена Pi-1 на этапе ВС1 (первое возвратное скрещивание). Комбинация скрещивания – C104-Lac (донор гена Pi-1) × Боярин. Для анализа использован микросателлитный маркер Rm 224, сцепленный с геном Pi-1.

На рисунке хорошо видна разнокачественность исследованных образцов по наследованию донорных аллелей целевого гена: образцы на дорожках 1, 2, 4,

6, 7, 8 (в отличии от образцов на дорожках 3 и 5) являются гетерозиготами по локусу Rm 224.

Растения, в генотипе которых ПЦР-анализ не выявил донорных аллелей устойчивости, выбраковывали. ВС3 – растения с наименьшим вегетационным пе- риодом и наибольшей фертильностью метелки и, по данным ДНК-анализа, не- сущие донорные аллели устойчивости, были отобраны для получения семян ВС3F-поколений. ДНК-анализ полученных популяций выявил образцы, несу- щие вводимые целевые гены в доминантном гомозиготном состоянии. Среди них удалось отобрать несколько, совмещавших в себе скороспелость, низкорос- лость, неосыпаемость и фертильность колосков. Семена этих растений были высеяны, в потомстве отобраны лучшие экземпляры и скрещены между собой для достижения эффекта пирамидирования целевых генов.

Фитопатологический   тест,   проведенный   лабораторией   защиты   риса ВНИИ риса в 2010 г. на вегетационной площадке института, выявил устойчи- вость одной из линий с пирамидированными генами устойчивости к пирикуля-

риозу (Pi-1+Pi-2+Pi-33) к смеси изолятов патогена, выделенных на территории

Краснодарского края.

 

Pi-1      1          2          3          4          5          6          7          8          Боярин

 

 

Рисунок 2 – Маркерный контроль наличия донорной аллели гена Pi-1 у растений ВС1- популяции

 

Примечание – экспериментальная популяция – ВС1 – растения от комбина- ции скрещивания C104-Lac (донор гена Pi-1) × Боярин (реципиентная родитель- ская форма); Pi-1 – линия C104-Lac; 1-8 – анализируемые ВС1-растения

 

Таким образом, полученный сортообразец риса – ценный исходный се- лекционный материал, который может быть использован в качестве донора ге- нов широкого спектра устойчивости к пирикуляриозу Рi-1, Pi-2, Pi-33. В кол- лекцию ВНИИ риса переданы также линии на генетической основе сорта Бо- ярин с интродуцированными методом маркерной селекции донорными генами устойчивости к патогену:

– два сортообразца с геном Рi-1; номера каталога коллекции ВНИИ риса

04433, 04434, соответственно;

– два сортообразца с геном Рi-2; номера каталога коллекции ВНИИ риса

04435, 04436, соответственно;

– два сортообразца с геном Рi-33; номера каталога коллекции ВНИИ риса

04437, 04438, соответственно.

В коллекцию ВНИИ зерновых культур им. И.Г. Калиненко (г. Зерноград, Ростовская область) переданы также линии на генетической основе сорта Ви- раж с интродуцированными методом маркерной селекции донорными генами устойчивости к патогену:

– сортообразец с геном Рi-2; номер каталога коллекции ВНИИЗК 5441/08;

–  сортообразец  с  геном  Рi-33;  номер  каталога  коллекции  ВНИИЗК

5485/08;

– сортообразец с генами Рi-1и Рi-33; номер каталога коллекции ВНИИЗК

54561/08.

В качестве резюме необходимо отметить, что в случаях, когда речь идет об интрогрессии одного или нескольких донорных генов, применение методов молекулярного маркирования является приоритетным способом создания ис- ходного селекционного материала с заданными признаками. Это становится особенно очевидным в тех случаях, когда фенотипически контролировать до- норный признак не представляется возможным по тем или иным причинам.

 

3.2 Использование технологии молекулярного маркирования для идентификации важных для селекции риса генов

3.2.1 Создание внутригенных ДНК-маркеров гена устойчивости к пи- рикуляриозу риса Pi-ta

По результатам более ранних исследований, одним из эффективных генов устойчивости риса к пирикуляриозу в Краснодарской зоне рисосеяния является ген Pi-ta (Коломиец Т.М., 1990). Ген Pi-ta секвенирован. Он расположен в обла- сти центромеры 12-й хромосомы (Kiyosawa S., 1981). В селекционных програм- мах на устойчивость риса к пирикуляриозу важно контролировать аллельное состояние переносимого донорного гена в гибридном потомстве, т.е. идентифи- цировать как доминантную, так и рецессивную аллели. С другой стороны, при массовом скрининге исходного селекционного материала на наличие изучаемо- го гена задача несколько иная: выявить донорные генотипы; при этом нет необ- ходимости контролировать аллельное состояние целевого локуса.

В этой связи нами была поставлена задача создания внутригенных кодо- минантного и доминантного молекулярных маркеров гена Pi-ta для осуществле- ния маркерного контроля при выполнении различных селекционных задач. Для дизайна праймеров использовали нуклеотидные последовательности доминант- ной (источник – сорт Yashiro-mochi) и рецессивной (источник – сорт Tsuyake) аллелей гена Pi-ta. Их номера в базе данных www.ncbi.nih.gov – AF207842 и AY196754, соответственно. Было проведено сравнение полученных нуклеотид- ных последовательностей доминантной и рецессивной аллелей гена Pi-ta с ис- пользованием  алгоритма  «multiple  sequence  alignment»  в  программе CLUSTALW (Hall T.A., 1999 г.). В результате был выявлен участок гена с еди- ничной олигонуклеотидной заменой у контрастных по изучаемому гену сортов. Ниже представлена точка полиморфизма гена Pi-ta у сортов риса, несущих до- минантную (внизу) и рецессивную (вверху) аллели гена:

cttctatctttacctgctatgcatcttcaacctgac cttctatctttaccttctatgcatcttcaacctgac

При создании кодоминантного маркера целевого гена дизайн двух праймерных пар был выполнен таким образом, чтобы в каждой паре праймеров один из них являлся специфичным для конкретной аллели. Аллельспецифич- ные праймеры каждой пары (F1 и R2) имели один общий нуклеотид в зоне SNP (single nucleotide polymorphism, точка единичной олигонуклеотидной замены). Дополнительные праймеры для каждой пары были подобраны произвольно, с точки зрения методического удобства (рис. 3).

 

 

 

Участок двух- цепо- чечной ДНК гена

Pi-ta

Точка

3'         SNP

 

5'

 

F2        F1

R2       R1

 

Точка

SNP

 

 

Рисунок 3 – Схема работы праймерных пар аллельспецифичного

ПЦР-маркера гена Pi-ta

Примечания

1 SNP – точка единичного олигонуклеотидного полиморфизма;

2  F1   и  R1    –  прямой  и  обратный  праймеры,  соответственно,  первой праймерной пары;

3  F2   и  R2    –  прямой  и  обратный  праймеры,  соответственно,  второй праймерной пары;

4 Стрелками указано направление синтеза ПЦР-продуктов

 

Нуклеотидная последовательность праймерных пар созданного кодоми- нантного маркера гена Pi-ta представлена в таблице 1.

Таблица 1 – Нуклеотидная последовательность праймеров для идентификации доминантной и рецессивной аллелей гена Pi-ta

 

Праймеры          Нуклеотидная последовательность праймерных пар

F1                                            gccgtggcttctatctttacctg

R1                                           atccaagtgttagggccaacattc F2                                            ttgacactctcaaaggactgggat R2                                           tcaagtcaggttgaagatgcataga

 

Рисунок 4 иллюстрирует апробацию маркера на контрастных по изучае- мому гену сортах риса. Размер ПЦР-продукта у сортов с доминантной и рецес- сивной аллелями гена отличается почти на 300 пар олигонуклеотидов, что поз-

воляет выполнять визуализацию продукта ПЦР-реакции как в полиакриламид- ном, так и в агарозном геле, что немаловажно с точки зрения методического удобства при проведении массовых анализов.

 

1          2          3          4          5          6

 

Рисунок 4 – Проверка эффективности кодоминантного маркера для иденти- фикации аллельного состояния гена Pi-ta ПЦР-методом

Примечание: 1 – Сорт К1 (положительный контроль); 2 – сорт Nippon- bare (отрицательный контроль); 3 – сорт Виктория; 4 – сорт IR36; 5 – сорт To- ride; 6 – сорт Ou 244

 

Таким образом, созданный маркер информативен для целей идентифи- кации аллельного состояния при проведении маркерного контроля изучаемо- го локуса в селекционных программах.

Для создания доминантного маркера гена Pi-ta была использована анало- гичная схема поисковой работы с некоторым отличием. После определения точки полиморфизма были сконструированы два, а не четыре аллельспецифич- ных праймера, причем прямой праймер, специфичный для доминантной аллели, начинался с полиморфной точки, а обратный выбран с точки зрения методиче- ского удобства.

Нуклеотидная последовательность сконструированных праймеров : F: GCTGCTTGTTCGAACAGCGCCTGC (24 п.о)

R: CAAGTCAGGTTGAAGATGCATAGC (24п.о)

Для проверки эффективности доминантного маркера была поставлена пробная ПЦР с ДНК контрастных по изучаемому признаку сортов риса: К1 (по- ложительный контроль) и Nipponbare (отрицательный контроль) (рисунок 5).

Из рисунка 5 видно, что аллельная миграция наблюдалась только в случае использования сорта, несущего доминантную аллель гена Pi-ta (положительный контроль); и отсутствовала у сорта с рецессивной аллелью гена (отрицательный контроль), что подтверждает эффективность созданного маркера.

 

Рисунок 5 – Проверка эффективности доминантного маркера гена Pi-ta

 

Примечание: mw – маркер молекулярного веса; сорт: К1 (положительный контроль), Nb – Nipponbare (отрицательный контроль)

 

Скрининг селекционного материала созданным маркером не выявил но- сителей доминантной аллели целевого гена среди 103 проанализированных сор- тообразцов контрольного питомника ВНИИ риса. Среди 33-х F7-линий (комби- нация скрещивания IR-58 x Кубань 3): у 22-х линий доминантная аллель гена Pi-ta оказалась в гомозиготном состоянии; у 3-х – в гетеризиготном; у 8 – отсут- ствовала вообще.

Таким образом, применение созданных внутригенных маркеров ускоряет селекционный процесс по гену Pi-ta, повышая его эффективность.

 

3.2.2  Создание  внутригенного  аллельспецифичного  ДНК-маркера гена красной окраски перикарпа риса Rc

Во всех зонах рисосеяния краснозерные формы являются злейшими засо- рителями полей и наносят рисоводству ощутимый вред, резко снижая товарную ценность семян. Данные, полученные лабораторией технологической оценки качества зерна ВНИИ риса, показывают, что каждый процент краснозерной примеси снижает урожай партии семян на 1,5-2,3\% (Туманьян Н.Г., 2001). В со- ответствии с ГОСТ Р 52325-2005, в посевах оригинальных и элитных семян риса не допускаются краснозерные формы. В репродукционных семенах и в се- менах, предназначенных для производства товарной продукции, примесь таких форм риса не должна превышать соответственно 0,5\% и 1,0\%. В этой связи для эффективного контроля сортовой чистоты семян риса особое значение приобре- тает технология выявления гена краснозерности Rc у растений задолго до непо- средственного фенотипического проявления признака (появление метелки), что дает возможность заблаговременно элиминировать нежелательные генотипы из дальнейшего размножения в процессе первичного семеноводства сортов.

В рамках данного исследования был создан внутригенный кодоминант- ный маркер гена Rc, выявляющий носительство доминантной аллели указанно- го гена вне зависимости от стадии онтогенеза растения риса. Для разработки и

дизайна праймеров были использованы нуклеотидные последовательности ал- лельной серии гена (www.ncbi.nih.gov; номера в базе данных: DQ204735, DQ204736, DQ204737 и DQ204738). Затем было проведено сравнение получен- ных нуклеотидных последовательностей с использованием алгоритма «multiple sequence alignment» в программе CLUSTALW (см. выше).

В результате была локализована делеция из 14 пар оснований у аллели rc белозёрного риса; и сконструированы четыре праймера, предварительно прове- ренных в системе поиска BLAST базы данных www.gramene.org, чтобы исклю- чить возможность амплификации неспецифичных зон ДНК с помощью этих праймеров:

F1 – ACAACACTGACACTGAAAGG; R1 – GCATCCACTTGCGCCTTTCC; F2 – GCAAGTGGAACGCGAAAAGT; R2 – TTCCAATGTTCGTTAGAGGC

Как показано на рисунке 6, два праймера (F1 и R2) являются аллельспеци- фичными, а два других – нет.

Рисунок 6 – Схема работы праймерных пар аллельспецифичного

ПЦР-маркера гена Rc

 

На рисунке аллельная серия локуса Rc (Rc/Rcs/Rc+) имеет обозначение Red, а аллель rc – White. Цифры, изображённые чёрным, показывают размер це- левых амплифицируемых фрагментов (п.о.), а цифры, изображенные серым – длину минорных фрагментов, амплифицируемых при постановке ПЦР со сме- сью обеих пар праймеров в одной пробирке (F1, R1  + F2, R2). Жирным пункти- ром показана делеция в 14 п.о., тонким пунктиром – участки, идентичные меж- ду аллелями. Стрелками – направление синтеза.

Первоначально температура отжига каждого праймера была рассчитана по формуле (см.выше); окончательная температура была подобрана эмпириче- ским путём. При проведении ПЦР в реакционной смеси была использована смесь праймеров.

Проверка эффективности созданного молекулярного маркера на отече- ственных сортообразцах риса, контрастных по изучаемому признаку, представ- лена на риунке 7.

 

 

Рисунок 7 – Аллельные различия в локусе Rc у краснозерных и белозерных сор- тов риса

Примечания

1 Краснозёрные сорта: 1 – Карат, 2 – Рубин, 4, 6, 8 – краснозерные анало - ги белозерных сортов Павловский, Спринт, Привольный, соответственно;

2 Белозерные сорта: 3 – Хазар, 5 – Павловский; 7 – Спринт;

3 «MW» – маркер молекулярного веса

4 Фрагмент, на который указывает стрелка, соответствует 790 п.о.

 

Из рисунка видно, что созданный маркер позволяет чётко различать ал- лельное состояние локуса Rc: доминантное (краснозёрность) и рецессивное (бе- лозёрность).

Для определения порога чувствительности описанной методики была проведена ПЦР с различным соотношением ДНК образцов красно- и белозёр- ного риса в одной пробирке, с использованием при этом одной пары праймеров, идентифицирующей доминантную аллель гена Rc (краснозерность). Для экс- тракции ДНК брали по 0,15 г биомассы зелёных листьев образца белозёрного сорта Павловский и краснозёрного – Карат. После достижения эквивалентности концентраций ДНК указанных образцов (800 мкг/мл в обеих пробах) ДНК сорта Карат разводили деионизированной водой в 50, 100, 200, 500 и 1000 раз.

ПЦР-анализ показал, что маркер способен точно выявить краснозерную аллель при соотношении ДНК краснозёрного риса к ДНК белозёрного вплоть до 1: 200.

Для полевой апробации созданной методики, проведенной в 2010 г. в ПИП1 ВНИИ риса на сортах Атлант, Ренар и Флагман, выделяли ДНК из об- щей биомассы листьев (стадия второго-третьего настоящего листа), отобран- ных от каждого растения каждой исследуемой «семьи» изучаемого сорта с по- следующей постановкой ПЦР и электрофореза.

В случае обнаружения доминантной аллели гена краснозёрности в иссле- дуемой группе («семье») растений эта группа полностью элиминируется из

ПИП1. Если же необходимо точно идентифицировать краснозерное растение, проводится ПЦР-анализ каждого растения делянки («семьи»).

В результате ДНК-анализа ни в одной из изученных семей не было обна- ружено растений с доминантной аллелью гена Rc.

Применение апробированной таким образом методики целесообразно для ежегодного контроля чистоты ПИП1 размножаемых отделом семеноводства и семеноведения института сортов риса от краснозерной примеси. При этом важ- но, что контроль можно начинать задолго до фенотипического проявления изу- чаемого признака (появление метелки), что повышает его надежность.

 

3.2.3 Изучение генетической природы краснозерных аналогов бело- зерных сортов в системе производственного выращивания риса

Как указывалось выше, краснозёрные формы риса являются злейшими за- сорителями рисовых полей. Особое место здесь занимают так называемые крас- нозерные аналоги белозерных сортов. Феномен таких аналогов состоит в появ- лении и прогрессивном нарастании числа краснозерных растений в рисовых че- ках с районированными белозерными сортами при производственном выращи- вании риса. При этом морфотипы белозерных и краснозерных растений очень схожи. Есть две основные обсуждаемые гипотезы о происхождении краснозер- ных аналогов. Эти формы могли возникнуть как вследствие мутаций в локусе Rc, сдвигающих рамку считывания, так и вследствие переопыления белозерных растений сорно-полевыми краснозерными формами риса.

В первом случае оригинальные сорта и их краснозерные аналоги генети- чески должны быть идентичными, за исключением локуса, в котором произо- шла мутация. Подобная ситуация описана в работе S.A. Brooks с соавторами на краснозёрной форме сорта Wells (Brooks S.A. et al., 2007).

Во втором случае сравнительный анализ ДНК оригинальных, белозерных сортов риса и их краснозерных аналогов должен выявить полиморфизм не толь- ко в мутантном, но и во многих других исследуемых локусах.

Для проверки этих гипотез нами была предпринята попытка попарного сравнения полиморфизма 30 ДНК (микросателлитных) локусов белозёрных сортов риса Бластоник, Виктория, Изумруд, Краснодарский-86, Кубань-3, Ли- ман, Павловский, Привольный, Соната, Спринт и их краснозёрных аналогов. Кластеризация изученных образцов (Олдендерфер М.С., Блэшфилд С.К., 1989) на основе проведенного микросателлитного анализа выявила наличие двух кла- стеров при разрезании иерархического дендрита на расстоянии 1,0 условной единицы: в первый кластер попали все белозерные сорта; во второй – все их краснозерные аналоги (рис. 8).

 

Рисунок 8 – Кластерный анализ сортов риса и их краснозерных аналогов на основе данных микросателлитного анализа

 

Из данных кластеризации следует, что:

1) изученные краснозерные аналоги не могли произойти от белозерных сортов в результате точковой мутации, так как аллельные различия исследован- ных 30 микросателлитных локусов ДНК в пределах каждой изученной пары (белозерный сорт и его краснозерный аналог) весьма существенны;

2) выявленное указанное несходство аллельного разнообразия микроса- теллитных локусов позволяют предположить, что краснозерные аналоги воз- никли в результате переопыления краснозёрными сорно-полевыми формами бе- лозерных растений риса с последующим многократным самоопылением по- следних в ряду поколений, результатом чего стало сильное сходство морфоти- пов полученных краснозерных гибридов с оригинальными белозерными сорта- ми, используемыми в производственном выращивании;

3) попадание всех изученных краснозерных аналогов в один кластер мо- жет свидетельствовать в пользу того факта, что растения изученных райониро- ванных белозерных сортов были когда-то переопылены одной или группой схо- жих по гентипу сорно-полевых форм риса, преобладающих в краснодарской зоне рисосеяния.

Очевидно, что подобный процесс происходит постоянно в ходе длитель- ного выращивания сортов риса в производственных условиях, являясь основ- ной причиной засорения зерна краснозерной примесью. Прогрессивное нарас- тание процента краснозерности в процессе возделывания белозерных сортов происходит вследствие погрешностей агротехнических приемов, применяемых для удаления сорняков с рисовых полей, включая краснозерные сорно-полевые

формы риса. В этой связи в вопросе контроля краснозерности в производствен- ных посевах риса становится понятной приоритетность агротехнических прие- мов.

 

3.3 Изучение биоразнообразия растительных ресурсов на основе мо- лекулярно-генетического подхода

В данном разделе исследования изучалось биоразнообразие сельскохо- зяйственно важных растений, вредоносных сорняков, а также грибных фитопа- тогенов для решения практических задач селекции и семеноводства.

3.3.1 Генетическая паспортизация отечественных сортов и сортооб- разцов риса (Oriza sativa L.) с использованием ПЦР-маркеров

 

Генетическая паспортизация создаваемых сортов и гибридов сельскохо- зяйственных растений в последнее время все более востребована их оригинато- рами, прежде всего, для оценки генетической чистоты реализуемых партий се- мян, а также для защиты авторских прав селекционеров.

Современный рынок семян сельскохозяйственных культур предъявляет жесткие требования к их сортовым качествам. Сортовая идентификация обяза- тельна при сертификации коммерческих партий семян. В последнее время все чаще для этого используются современные методы молекулярного маркирова- ния как наиболее достоверные и надежные.

В этой связи была проведена ДНК-паспортизация 39 сортов и сортообраз- цов коллекции ВНИИ риса с последующей их кластеризацией на основе сходства микросателлитных локусов ДНК. Для этого было использовано 14

«нейтральных» микросателлитных маркеров. Изученные маркеры проявили различный уровень полиморфизма: от трех до семнадцати аллелей на один ми- кросателлитный локус с максимальным полиморфизмом по локусам RM 70 и RM 164.

В качестве иллюстрации на рисунке 9 представлено алллельное разнооб- разие у 18 сортов и сортообразцов коллекции ВНИИ риса в микросателлитном локусе RM 164.

Каждый изученный сорт (сортообразец) обладал уникальным набором микросателлитных аллелей. В ходе эксперимента не было найдено ни одной пары сортов с полностью идентичным аллельным разнообразием по 14 изучен- ным локусам. По результатам микросателлитного анализа была выполнена кла- стеризация сортов и сортообразцов риса по методу Ward (Олдендерфер М.С., Блэшфилд С.К.,1989). В результате было выявлено два кластера (рис.10).

 

1          2          3          4          5          6          7          8          9          10  11  12        13  14  15        16        17        18

 

 

Рисунок 9 – Аллельная миграция в локусе RM 164 у 18 сортов и сортообразцов коллекции ВНИИ риса

 

Примечание – Стрелками указан маркер молекулярного веса; 1-18 – сорта и сортообразцы

Рисунок 10 – Кластерный анализ 39 сортов и сортообразцов риса, по дан- ным микросателлитного анализа

Достоверность межкластерных различий была подтверждена одним из многомерных статистических методов – дискриминантным анализом. При раз- делении двух групп (кластеров) была получена только одна дискриминантная функция. Ее анализ показал, что кластеры различаются статистически досто- верно, о чем свидетельствует нулевое значение вероятности нуль-гипотезы.

В результате проведенного генотипирования создана база данных, содер- жащая информацию об аллельном разнообразии 14-ти микросателлитных локу- сов ДНК изученных сортов и сортообразцов из коллекции ВНИИ риса, которая в  случае  необходимости  может  быть  использована  оригинатором  сортов (ВНИИ риса) для защиты авторских прав селекционеров. Для практической се-

лекции риса кластеризация генотипов на основе ДНК-анализа, отражающая сте- пень генетического сходства между ними, может быть с успехом использована при подборе родительских пар для гибридизации с целью получения макси- мального спектра изменчивости в гибридном потомстве.

 

3.3.2 Использование технологии молекулярного маркирования для оценки генетической однородности семян простых гибридов F1 подсолнеч- ника (Helianthus annuus L.) для применения в практическом семеноводстве культуры

Для гетерозисных сельскохозяйственных культур – гибридный подсол- нечник, кукуруза, болгарский (сладкий) перец – чистосортность семян (гибрид- ность) особенно важна, так как в данном случае урожай напрямую зависит от процента гибридных зерновок (семянок) в реализуемой партии семян. В усло- виях жесткой конкуренции на современном рынке семян требования к их каче - ству сильно возросли. Например, согласно ГОСТ Р 52325-2005, сортовая типич- ность семян подсолнечника у родительских форм простых гибридов (линий) в реализуемой партии должна быть не менее 99,8\%.

В случае необходимости быстрой проверки семян на сортовую принад- лежность и сортовую чистоту, например, при торговых операциях, традицион- ные методы (апробация и грунтовой контроль) не могут быть использованы, так как из-за их сезонности и длительности они дают информацию скорее констатирующую, чем упреждающую. В такой ситуации  лабораторный контроль – единственный действенный инструмент оценки генетической одно- родности реализуемой партии семян.

Целью данного раздела была оптимизация системы молекулярного мар- кирования для оценки генетической однородности партий семян трех простых гибридов подсолнечника F1 отечественной селекции на основе ДНК-анализа (путем маркирования микросателлитных локусов ДНК) для последующего при- менения в практическом семеноводстве изученных гибридов.

Схема эксперимента состояла из следующих этапов:

– проведен поиск ДНК-маркеров в базе данных (www.ncbi.nih.gov), в ре- зультате которого отобраны микросателлитные маркеры, выявившие, по ли- тературным данным, максимальное аллельное разнообразие при скрининге раз- личных коллекций подсолнечника;

– оценен полиморфизм шести отобранных микросателлитных локусов между инбредными линиями подсолнечника – родительскими формами изучае- мых простых гибридов;

– отобраны четыре проявившие полиморфизм маркера, информативные для работы с изучаемыми простыми гибридами подсолнечника;

– выполнена оптимизация условий ПЦР для использованных в работе ми- кросателлитных маркеров;

– проведена оценка генетической чистоты (гибридность) партий семян простых гибридов подсолнечника Махаон 40, Махаон, Светлана (оригинатор – компания «Агроплазма», г. Краснодар) на основе ДНК (микросателлитного) анализа.

Исследования велись с использованием отобранных маркеров (Hа1327-ar, Ha1442-ar, Ha1608-ar, Ha1796-ar). Рисунок 11, например, иллюстрирует оценку полиморфизма микросателлитных локусов НА 1796- ar и НА 1442-ar между во-

семью инбреднными линиями подсолнечника.

 

 

Рисунок 11 – Оценка полиморфизм микросателлитных локусов НА 1796-ar и НА 1442-ar между инбредными линиями – родительскими формами простых гибридов подслнечника (оригинатор линий – компания «Агроплазма», г. Крас- нодар)

 

Примечание – Номерами обозначены инбредные линии:

а) при скрининге маркером Ha 1796 ar: 1- BС 42; 2- AM 08; 3- АМ 40; 4- AC 42; 5- RM 02; 6- BM 42; 7- RB; 8- AM 32; б) при скрининге маркером Ha

1442 ar: 1- BС 42; 2- AM 08; 3- АМ 40; 4- RM 02; 5- BM 42; 6- AC 42; 7- AM 32;

8- RB

Маркеры, оказавшиеся полиморфными между родительскими линиями каждой анализируемой гибридной комбинации, были использованы для оценки гибридности реализуемых партий семян этой комбинации (рис.12).

 

 

Рисунок 12 – Аллельное разнообразие в локусе НА 1327-ar у семянок простого гибрида подсолнечника Махаон 40

 

Примечание – № 9, 10 – материнская и отцовская инбредные линии дан- ного гибрида, соответственно

 

Из рисунка видно, что из 18 представленных на данной электрофореграм- ме семянок как «отцовская», так и «материнская» аллели в данном локусе при- сутствует у 8 (№№ 2, 3, 6, 7, 14, 17, 18, 20), которые, таким образом, являются гибридными. Остальные семянки несут только «материнскую» аллель и, следо- вательно, не являются гибридными.

По результатам посеменного микросателлитного анализа (изучаются ми- кросателлитные профили ДНК-локусов каждой из 100 исследуемых семянок) была проведена оценка генетической однородности (процент гибридных семя- нок на 100 исследуемых) коммерческих партий семян указанных гибридов, подлежащих реализации. Кроме того, данный анализ был использован для про- верки генетической однородности родительских линий этих гибридов.

Гибридные семянки проверенных лабораторным методом партий подсол- нечника были высеяны в поле для проведения так называемого грунт-контроля (оценка генетической однородности по данным морфотипа) (табл. 2).

Несколько заниженный процент генетической однородности исследуе- мых гибридов подсолнечника, полученный нами по результатам лабораторного теста (отсутствие разнокачественности микросателлитных профилей между анализируемыми семянками), по сравнению с данными полевого тестирования (оценка однородности растений по морфотипу) может быть, в числе прочих причин, обусловлен также и тем, что при созревании гибридов на участках ги- бридизации нельзя полностью исключить переопыление материнской линии ги- брида другой формой, генетически близкой к отцовской. В таком случае вы- явить указанные генетические различия при грунтконтроле, основываясь на данных морфотипа, может быть затруднительно, а чувствительность ДНК-ме- тода позволяет это сделать.

Таблица 2 – Результаты анализа генетической однородности семян реализуе- мых партий простых гибридов подсолнечника (данные 2009 г.)

 

 

 

 

Гибрид

 

 

 

Сортовая чистот цент  гибридных

а (про- расте-

Сортовая чистота (процент ги- бридных семянок) по результатам

 

партии

 

ний) по данным контроля

грунт-

лабораторного ДНК(микросател- литного) анализа

 

Махаон

615

 

97,9

 

88

 

Махаон 40

641

 

97,5

 

85

 

 

 

Для получения более сопоставимых результатов в дальнейшем предло- женная методическая схема должна быть усовершенствована по следующим направлениям:

– строгое соблюдение технологического регламента при выращивании ги- бридов на участках гибридизации (соблюдение пространственной изоляции по- севов, выкашивание отцовской линии гибрида сразу после опыления, до созре- вания семянок);

– увеличение количества исследуемых микросателлитных локусов, поли- морфных между родительскими инбредными линиями, при ДНК-анализе ги- бридных семянок.

Резюмируя сказанное, необходимо отметить, что генетическое разнообра- зие микросателлитных локусов ДНК можно с успехом использовать как надеж- ный признак для оценки сортовых качеств семян гибридного подсолнечника (как и ряда других гетерозисных культур) и получать достоверные данные о чи- стосортности семян в упредительном режиме, не дожидаясь результатов грунт- контроля. Тем более что последние, в подавляющем большинстве случаев, воз- можны только на следующий после получения гибридных семян вегетацион- ный сезон. Иными словами, реализовывать партии семян зачастую приходится

«вслепую», не имея полной уверенности в их гибридности или гибридности, полученной в результате опыления отцовской формой гибрида.

 

3.3.3 Изучение меж- и внутривидового разнообразия злостного сорня- ка рода Echinochloa методом молекулярного маркирования

Ежовник куриное просо (просянка), Echinochloa crussgalli – наиболее рас- пространенный сорняк в рисоводстве на территории стран СНГ. Увеличение числа побегов этого сорняка до 200 и более на 1 м2  снижает продуктивность риса до 50\% и более. Это однолетние растения с огромным коэффициентом ку- щения. Отдельные растения формируют до 58 побегов, высота 90-170 см, ино- гда достигает 200 см. (Агарков В.Д., Касьянов А.И., 2000).

Целью данного раздела исследования было изучение внутри- и межвидо- вого  биоразнообразия  злостного  сорняка  рисовых  полей  рода  Echinochloa

(ежовники) в рисосеющих регионах стран СНГ на основе ДНК (микросателлит- ного) анализа различных экотипов сорняка, а также молекулярно-генетическое обоснование наличия огромного количества переходных форм и схожих морфо- логических признаков у представителей разных таксонов целевого рода, за- трудняющих точную идентификацию растений.

Кроме того, точная идентификация и характеристика генетических взаи- мосвязей этого проблемного сорняка поможет разработать подробные рекомен- дации по применению гербицидов, целенаправленно поражать отдельные эко- типы меньшим количеством химикатов. С другой стороны, зональная ДНК-пас- портизация экотипов сорняка, преобладающих в том или ином рисосеющем регионе, может использоваться в селекционных схемах, направленных на со- здание сортов риса с высокой энергией роста из-под слоя воды при использова- нии безгербицидной технологии борьбы с сорняками рисовых полей.

В ходе экспедиционных поездок, проводившихся в течение семи вегета- ционных сезонов (2005-2011 гг.), были обследованы 37 районов Краснодарско- го края, а также часть территории Ростовской области (побережье Таганрогско- го залива, берега лиманов за г. Таганрог), где собран гербарный материал целе- вого сорняка. В результате выполнено картирование указанных территорий по распространенности сорняка.

Собранные в ходе экспедиций растения описаны по морфотипу и иденти- фицированы в соответсвии с таксономическими ключами, принятыми в России, (Косенко И.С., 1970).

Далее был проведен ДНК- анализ 80 идентифицированных по морфотипу растений для выявления генетического сходства растений как на меж-, так и внутривидовом уровне. Сформирована пополняемая база данных, содержащая информацию об аллельном разнообразии микросателлитных локусов ДНК изу- ченных образцов целевого сорняка. В эксперимент были также включены об- разцы из коллекции ВНИИ риса, собранные ранее на рисосеющих территориях Украины и Астраханской области России.

Были использованы 4 микросателлитных маркера – ЕС1, ЕС2, ЕС3, ЕС5, созданные для изучения биоразнообразия рода Echinochloa (Danquah E.Y. et al.,

2002). ДНК-анализ показал, что выявленное аллельное разнообразие исследо- ванных локусов оказалось невелико (рис. 13). В локусе Ech 1, например, среди всех исследованных образцов обнаружено три аллели, в локусе Ech 5 – всего две аллели.

Последующий статистический анализ экспериментальных данных, вы- полненный методом Ward (Олдендерфер М.С., Блэшфилд С.К., 1989) преследо- вал целью классификацию образцов по общности генотипов (рис. 14).

В результате разрезания иерархического кластерного дендрита на уровне

4 усл. ед. было выявлено три кластера. При этом не было выявлено очевидной зависимости между таксономической принадлежностью растений, местом произрастания и их кластерной принадлежностью. Так, образцы растений разных видов изучаемого рода, например, Echinochloa crussgalli (образец № 03

– 5-21, собран в Херсонской области Украины) и Echinochloa orizoides (образец

№ 03-12-4, собран в г. Пролетарск, Ростовской области), произраставшие, кро- ме того, в отдаленных друг от друга эколого-географических зонах, попали в один кластер.

Сходство микросателлитных профилей изученных образцов может свиде- тельствовать в пользу существующего в природе процесса естественного перео- пыления растений, принадлежащих к разным таксонам исследуемого рода и, вследствие этого, наличия огромного количества переходных форм, описанных ботаниками и затрудняющих точную идентификацию растений целевого рода. Это, в свою очередь, привело к сходству локусов ДНК, что проиллюстрировал микросателлитный анализ. Таким образом, экспериментальные данные ДНК-а- нализа подтвердили гипотезу внутри- и межвидового скрещивания, существую- щего в природных популяциях сорняка (Danquah E.Y. et al., 2002).

 

Рисунок 13 – Аллельное разнообразие в локусе Еch1 у 16 исследованных гер- барных образцов растений рода Echinochloa, собранных в различных эколо- го-географических районах рисосеяния

Примечания – 1 Крайняя левая дорожка – маркер молекулярного веса; 2

Последующие 16 дорожек слева направо – изученные гербарные образцы расте- ний рода Echinochloa

 

 

Рисунок 14 – Результаты кластерного анализа 55 образцов растений рода

Echinochloa (ежовники), (по данным микросателлитного анализа) Примечание – По оси абцисс – номера изученных образцов ежовников

 

3.3.4 Изучение биоразнообразия образцов российской государствен- ной коллекции Magnoporthe grisea (Herbert) Barr (возбудителя пирикуля- риоза риса) методом молекулярного маркирования.

 

Мониторинг расового состава возбудителя пирикуляриоза (наиболее вредоносного заболевания риса во всех рисосеющих регионах мира) необходим для разработки правильной селекционной стратегии в создании устойчивых сортов этой важнейшей сельскохозяйственной культуры.

В этой связи целью данного раздела работы было изучение генетического разнообразия возбудителя пирикуляриоза риса на основе молекулярно-генети- ческого подхода, исследуя полимрфизм 21-го ДНК (микросателлитного) локуса патогена.

Сравнение «ДНК-паспортов» рефренсных изолятов с известным патоти- пом с таковыми у вновь выделенных полевых изолятов может дать информа - цию о степени их генетического сходства. Значительное сходство в данном слу- чае позволяет предположить также и сходство их патотипов. Такая информация чрезвычайно важна для селекционеров.

При экспериментальном подтверждении данного предположения эта стратегия могла бы стать неплохой альтернативой классическому фитопатоло- гическому способу генотипирования полевых изолятов паразита (использующе- му сорта-дифференциаторы растения-хозяина с известными генами устойчиво- сти к паразиту). Молекулярно-генетический подход значительно облегчает и ускоряет выполнение указанной задачи.

В этой связи в рамках данного исследования проведена генетическая пас- портизация изолятов государственной коллекции Magnoporthe grisea, держа- телем которой является Всероссийский научно-исследовательский институт фитопатологии (ВНИИФ, п. Большие Вяземы, Московская область).

ДНК 59 изолятов коллекции с известным патотипом, охарактеризован- ных, кроме того, по комплексу культурально-морфологических свойств, была любезно предоставлена для проведения молекулярного (микросателлитного) анализа сотрудниками лаборатории микологии и иммунитета ВНИИФ.

На рисунке 15 проиллюстрировано аллельное разнообразие исследован-

ных изолятов патогена в микросателлитном локусе Pyrms 99-100.

 

 

Рисунок 15 – Аллельное разнообразие, выявленное у коллекционных изолятов возбудителя пирикуляриоза риса в локусе Pyrms 99-100

 

Примечания

1 Крайние дорожки электрофореграммы – маркер молекулярного веса;

2 Изоляты: 1 – КП-10.83, 2 – ОК-28sem, 3 – ХС-21 R1122.84, 4 – ОК-

23met, 5 – КП-74usl.85, 6 – ОК-19 R7.86, 7 – ОК-26 R1122-1122-1118, 8 – F-67-

57п.95-85 R1117, 9 – КК-96usl2, 10 – КК-96usl.3, 11 – КП-57мет R1114, 12 – 138

AR1119, 13 – ХК-40 R335п42-90R1119, 14 – КК-97-24, 15 – КК-97-4 3, 16 – КК-

97-8

 

У изученных образцов микросателлитные маркеры проявили различный уровень полиморфизма: от двух до двенадцати аллелей на один локус с макси- мальным полиморфизмом по маркерам Pyrms 43 – 44, Pyrms 59 – 60, Pyrms 99 –

100 и Pyrms 125 – 126.

По результатам эксперимента была составлена матрица и выполнена кла- стеризация изолятов фитопатогена по степени сходства их ДНК-локусов. Для этой  цели  использовали  кластерный  анализ  по  методу  Ward  (Олдендерфер М.С., Блэшфилд С.К., 1989). Результаты кластеризации представлены на рисун- ке 16.

Рисунок 16 – Кластерный анализ изученных изолятов Magnoporthe grisea (Her- bert) Barr, по данным микросателлитного анализа

 

В результате разрезания иерархического кластерного дендрита на уровне

0,6 усл.ед. были выделены четыре кластера. «Емкость» кластеров была различ- ной и варьировала от 10 до 20 изолятов. Очевидно, что в первом кластере преобладают изоляты японского происхождения; туда же относятся оба фран- цузских изолята, во втором – изоляты, собранные на территории Краснодарско- го края. Третий кластер целиком состоит из изолятов украинского происхожде- ния. К четвертому относятся украинские и российские, а также японские изоля- ты (табл. 3).

Таблица 3 – Доля изолятов патогена разного географического происхождения в кластерах (\%)

 

 

кластера

 

 

Емкость кластера

 

Украина         Краснодар-

Происхождение

 

Средняя

(шт.)

ский край       Франция         Япония

Aзия

 

1

20

20

10

10

60

0

2

12

8

59

0

25

8

3

17

100

0

0

0

0

4

10

60

30

0

10

0

Окончательное решение вопроса о различиях между кластерами было по- лучено с использованием дискриминантного анализа, который подтвердил, что кластеры изолятов действительно различаются друг от друга.

Проведенное в рамках данной работы генотипирование изолятов возбуди- теля пирикуляриоза риса с известным патотипом из государственной коллекции патогена позволило создать генетические «отпечатки» каждого изолята, на основе чего сформирована база данных. Это позволит в дальнейшем проводить сравнительную характеристику микросателлитного профиля каждого вновь вы- деленного полевого изолята паразита из различных зон рисосеяния с таковыми из базы данных, оценивая, таким образом, степень их генетического сходства.

Как указывалось выше, при значительном сходстве микросателлитных профилей рефренсных (с известным патотипом) и новых полевых изолятов вы- соковероятно также и сходство их патотипов. Это, в свою очередь, дает селек- ционером ценную информацию об эффективных в данной зоне рисосеяния ге- нах устойчивости риса к возбудителю пирикуляриоза.

Такой подход особенно эффективен в ситуациях, когда корректно прове- сти классический фитопатологический тест с привлечением сортов-дифферен- циаторов для выяснения патотипа изучаемой популяции паразита не представ- ляется возможным.

Среди всех изученных изолятов не было обнаружено двух с идентичным набором микросателлитных аллелей. Таким образом, результат эксперимента показал эффективность использования полиморфизма микросателлитных локу- сов для изучения генетического разнообразия возбудителя пирикуляриоза риса.