Общая характеристика работы

Актуальность темы. Генетическое разнообразие, природное или со- зданное человеком, является основой для выведения новых сортов сельскохо- зяйственных растений.

Современные сорта сельскохозяйственных культур должны удовлетво- рять основным требованиям:

– обладать высоким урожаем и хорошим качеством продукции;

– быть хорошо адаптированными к зональным агротехнологиям;

– быть устойчивыми к биотическим и абиотическим стрессовым факторам.

Маркерная селекция значительно упрощает процесс создания таких сор- тов, ускоряя и делая более эффективным отбор растений с интересующими се- лекционера генами. В случае доказанного факта сонаследования целевого гена и сцепленного с ним молекулярного маркера отпадает необходимость оценки отбираемых растений по фенотипу (например, создание инфекционных фонов, абиотических стрессовых условий и т.д.), которая в ряде случаев связана со зна- чительными трудозатратами и технически трудновыполнима.

Генетические маркеры играют исключительно важную роль в изучении наследственной конституции организма и, в особенности, в оценке исходного селекционного материала, поскольку облегчают контроль за включением жела- емых (и нежелаемых) генетических факторов от родительских форм в создавае- мые сорта и гибриды.

Для сравнения следует отметить, что средняя продолжительность селек- ционных схем, основанных на классических методах гибридизации и отбора растений, для однолетних культур около 10, а для двулетних – до 20 лет.

Прогресс молекулярной генетики дал толчок к развитию различных типов ДНК-маркеров, основанных на анализе полиморфизма нуклеотидной последо- вательности ДНК. Их использование коренным образом изменило методы оценки генетического разнообразия, паспортизации и классификации сортов растений и штаммов грибов, картирования и определения физической природы генов, интрогрессии новых генов и генетического мониторинга в селекции и ге- нетике сельскохозяйственных растений.

Цель и задачи исследований. Основной целью исследований являлась разработка  и  обоснование  эффективности,  целесообразности  методических схем, использующих молекулярное маркирование в практической селекции и

семеноводстве сельскохозяйственных культур, а также при изучении биоразно- образия растительных ресурсов.

Для достижения цели исследований были поставлены следующие задачи:

1. Методом маркерной селекции создать исходный селекционный матери- ал (линии) риса с пирамидированными генами устойчивости к пирикуляриозу для использования его в качестве донорного в селекционных программах, направленных на создание устойчивых к патогену сортов риса.

2. Создать ДНК-маркеры для идентификации аллельного состояния эф- фективного в зоне краснодарского рисосеяния гена устойчивости риса к пири- куляриозу Pi-ta. Обосновать эффективность схем оценки исходного селекци- онного материала на наличие целевого гена, а также маркерного контроля гена Pi-ta в селекционных программах на основе ДНК-анализа.

3. Создать аллельспецифичный ДНК-маркер гена красной окраски пери- карпа риса Rc для ранней диагностики (до появления метелок) подлежащих элиминации краснозерных форм в питомниках размножения в системе первич- ного семеноводства риса.

4. Обосновать целесообразность методологии контроля краснозерной примеси в системе первичного семеноводства риса, основанной на молекуляр- ном маркировании локуса Rc.

5. Изучить генетическую основу феномена краснозерных аналогов бело- зерных сортов в производственных посевах риса на основе молекулярно-гене- тического подхода. Рекомендовать меры борьбы с краснозерностью при произ- водственном выращивании риса.

6. Выполнить генетическую паспортизацию отечественных сортов риса селекции ВНИИ риса и коллекционных сортообразцов института с использова- нием ПЦР (микросателлитных) маркеров. Создать базу данных, содержащую информацию об аллельном разнообразии изученных микросателлитных локу- сов у образцов коллекции для использования ее в селекционном процессе и для защиты авторских прав селекционеров.

7. Изучить внутри- и межвидовое биоразнообразие злостного сорняка рисовых полей рода Echinochloa (ежовники) в рисосеющих регионах стран СНГ на основе ДНК (микросателлитного) анализа различных экотипов сорняка. Дать молекулярно-генетическое обоснование наличию большого количества пере- ходных форм и схожих морфологических признаков у представителей разных таксонов целевого рода, затрудняющих точную идентификацию растений.

8. Создать пополняемую базу данных, содержащую информацию об ал- лельном разнообразии четырех микросателлитных локусов ДНК растений эко- типов рода Echinochloa из различных эколого-географических зон рисосеяния

стран СНГ для изучения генетических взаимосвязей таксонов рода. Обосновать целесообразность ее применения в селекционных схемах на создание сортов риса с высокой энергией роста из-под слоя воды (безгербицидная технология борьбы с сорняками).

9. Создать пополняемую базу данных, содержащую информацию об ал- лельном разнообразии 21 микросателлитного локуса ДНК рефренсных коллек- ционных штаммов с известным патотипом из российской государственной кол- лекции Magnoporthe grisea (Herbert) Barr – возбудителя пирикуляриоза риса. Обосновать целесообразность ее применения в селекционных программах на устойчивость риса к пирикуляриозу при изучении биоразнообразия вновь выде- ленных полевых изолятов патогена.

10. Оптимизировать систему молекулярного маркирования для оценки ге- нетической однородности партий семян простых гибридов подсолнечника (He- lianthus annuus L.). Обосновать целесообразность применения данной методоло- гии в практическом семеноводстве изученных гибридов подсолнечника.

Научная новизна исследований. Впервые методом маркерной селекции на генетической основе отечественных сортов риса (Боярин, Вираж, Виктория) создан исходный селекционный материал (линии с интродуцированными и, в том числе, с пирамидированными генами Pi1, Pi2, Pi33, придающими длитель- ную устойчивость к пирикуляриозу). При фитопатологическом тестировании на вегетационной площадке ВНИИ риса линии оценены как устойчивые к смеси изолятов патогена, выделенных на территории Краснодарского края.

Созданы внутригенные ДНК-маркеры для идентификации аллельного со- стояния эффективного в зоне краснодарского рисосеяния гена устойчивости к пирикуляриозу риса Pi-ta, исключающие необходимость фитопатологического теста для выявления донорных генотипов.

Впервые поиск доноров гена Pi-ta среди российских коллекционных об- разцов риса был осуществлен без применения классической фитопатологиче- ской методики: заражения совместимыми расами паразита, а только на основа- нии данных ДНК-анализа.

Создан внутригенный аллельспецифичный ДНК-маркер гена красной окраски перикарпа риса Rc для ранней диагностики (задолго до фенотипическо- го проявления признака) краснозерной примеси, засоряющей посевы риса. Впервые разработана методическая схема контроля краснозерных форм в пер- вичных звеньях семеноводства риса на основе данных ДНК-анализа. Определен порог разрешающей способности методики и проведена ее полевая апробация.

Впервые на основе молекулярно-генетического подхода изучена генети- ческая основа феномена краснозерных аналогов белозерных сортов риса, резко

снижающих товарную ценность семян. Обосновано предположение о переопы- лении сорно-полевыми краснозерными формами риса возделываемых белозер- ных сортов с последующим самоопылением последних в ряду поколений как наиболее вероятной причине возникновения краснозерных аналогов. Рекомен- дованы меры борьбы с краснозерностью при производственном выращивании

риса

Впервые проведена ДНК-паспортизация сортов и сортообразцов риса коллекции ВНИИ риса. Создана база данных, содержащая информацию об ал- лельном разнообразии микросателлитных локусов изученных генотипов, кото- рая может быть использована в селекционном процессе для подбора родитель- ских форм при гибридизации, а также для защиты авторских прав селекцио- неров.

Впервые биоразнообразие экотипов злостного сорняка рода Echinochloa (ежовники), собранных из разных зон рисосеяния стран СНГ, изучено методом молекулярного маркирования (микросателлитный анализ). ДНК-анализ под- твердил гипотезу внутри- и межвидового скрещивания, существующего в при- родных популяциях сорняка, объясняющую наличие большого количества переходных форм и схожих морфологических признаков у представителей разных таксонов.

Впервые проведено генотипирование образцов российской государствен- ной коллекции Magnoporthe grisea (Herbert) Barr – возбудителя пирикуляриоза риса – на основе полиморфизма микросателлитных локусов ДНК патогена. Со- здана база данных, позволяющая оценивать степень генетического сходства вновь выделенных полевых изолятов и коллекционных образцов с известным патотипом.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Исходный селекционный материал для создания сортов риса, устойчи- вых к пирикуляриозу, – линии с интродуцированными генами устойчивости к патогену Pi1, Pi2, Pi33, полученные методом маркерной селекции; в их числе – линия с тремя пирамидированными указанными генами.

2. Доминантный ПЦР-маркер для выявления доноров эффективного гена устойчивости к пирикуляриозу Pi-ta. Проведенный автором массовый ПЦР-ана- лиз коллекционных образцов риса – эффективный лабораторный и единствен- ный способ идентификации донорных генотипов при отсутствии совместимых рас патогена.

3. Кодоминантный ПЦР-маркер гена Pi-ta, с помощью которого возможен маркерный контроль аллельного состояния целевого гена в расщепляющихся

популяциях в селекционных программах, направленных на создание устойчи- вых к пирикуляриозу сортов риса,

4. Методическая схема контроля краснозерной примеси в питомниках размножения первичных звеньев семеноводства риса на основе созданного ПЦ- Р-маркера, идентифицирующего аллельное состояние гена красной окраски пе- рикарпа риса Rc задолго до фенотипического проявления признака (появление метелки), повышающая качество контроля. Полевая апробация методической схемы показала ее эффективность для контроля чистоты питомников размноже- ния от засорения краснозерными формами.

5. База данных, содержащая данные об аллельном разнообразии 14 ми- кросателлитных локусов ДНК коллекционных сортообразцов и районирован- ных сортов риса селекции ВНИИ риса. Генотипирование сортообразцов риса на основе полиморфизма ДНК (микросателлитных) – локусов целесообразно ис- пользовать в селекционном процессе, для более эффективного подбора роди- тельских пар при гибридизации. При этом один из основных критериев подбора

– разнокачественность микросателлитных профилей родительских форм плани- руемой комбинации скрещивания по большинству изученных локусов. В этом случае можно рассчитывать на гетерозисный эффект.

6. Оптимизация системы молекулярного маркирования для оценки гене- тической чистоты партий семян изученных в рамках исследования простых ги- бридов подсолнечника отечественной селекции для последующего использова- ния в семеноводстве этих гибридов.

7. База данных, содержащая данные об аллельном разнообразии 21-го ми- кросателлитного локуса ДНК образцов российской государственной коллекции Magnoporthe grisea (Herbert) Barr – возбудителя пирикуляриоза риса. Сравни- вая микросателлитные профили вновь выделенных полевых изолятов и коллек- ционных образцов патогена с известным патотипом, можно оценивать степень их генетического сходства. Это усовершенствует селекционный процесс при создании устойчивых к пирикуляриозу сортов риса, облегчая генотипирование зональных популяций паразита.

8. База данных, содержащая данные об аллельном разнообразии 4-х ми- кросателлитных локусов ДНК экотипов злостного сорняка рисовых полей рода Echinochloa (ежовники), собранных из разных зон рисосеяния стран СНГ, для использования ее при изучении зависимости отзывчивости разных генотипов сорняка на гербициды, применяемые в системе рисоводства в России, а также в селекционных программах, направленных на создание сортов риса с высокой энергией роста из-под слоя воды при безгербицидной технологии борьбы с сор - няками рисовых полей.

Практическая значимость работы. Созданные линии риса на генетиче- ской основе отечественных сортов с интродуцированными генами широкого спектра устойчивости к пирикуляриозу Pi1, Pi2, Pi33, а также линия с тремя пи- рамидированными указанными генами представляют собой ценный исходный материал, который может быть использован в качестве донорного в селекцион- ных программах, направленных на создание устойчивых к пирикуляриозу сор- тов риса.

Использование  созданного  доминантного  ДНК-маркера  эффективного гена устойчивости к пирикуляриозу Pi-ta для массового скрининга коллекцион- ных образцов риса повышает скорость и эффективность поиска доноров указан- ного гена, и, кроме того, избавляет от необходимости оценки образцов по фено- типу (фитопатологический тест, требующий наличия совместимых рас патоге-

на).

Маркерный контроль гена Pi-ta на основе созданного кодоминантного маркера в селекционных программах, направленных на создание устойчивых к пирикуляриозу сортов риса, позволяет в значительной степени (в два раза) ускорять селекционный процесс по указанному гену.

Использование методической схемы контроля краснозерной примеси в первичных  звеньях  семеноводства  риса  на  основе  созданного  ДНК-маркера гена красной окраски перикарпа риса Rc делает возможной раннюю диагности- ку краснозерных форм с их последующей элиминацией из питомников размно- жения, что повышает надежность контроля.

Созданная база данных, содержащая информацию о полиморфизме ДНК (микросателлитных)  локусов  районированных  сортов  риса  селекции  ВНИИ риса, а также коллекционных сортообразцов, может быть использована как в селекционном процессе, для более эффективного подбора родителских пар при гибридизации, так и для защиты авторских прав селекционеров.

Оптимизированная методическая схема контроля гибридности партий се- мян трех простых гибридов подсолнечника и генетической чистоты их роди- тельских линий на основе ДНК (микросателлитного) анализа повышает эффек- тивность семеноводства изученных гибридов; позволяя оценивать генетиче- скую чистоту семян вне зависимости от сезона вегетации, а при необходимо- сти, и в упредительном режиме, не дожидаясь результатов грунт-контроля.

ДНК-паспортизация рефренсных изолятов возбудителя пирикуляриоза (Magnoporthe grisea (Herbert) Barr) из российской государственной коллекции патогена может использоваться для изучения их генетического сходства с вновь выделенными полевыми изолятами паразита для изучения их генетического сходства. Это повышает эффективность селекционных схем, направленных на создание устойчивых к пирикуляриозу сортов риса.

Реализация результатов исследований. Созданный в рамках диссерта- ционного исследования исходный селекционный материал риса (сортообразцы на генетической основе сортов Боярин, Вираж, Виктория, в которые методом маркерной селекции автором были интродуцированы гены устойчивости к пи- рикуляриозу Рi-1, Pi-33, Pi-2) передан в коллекции ВНИИ риса (г. Краснодар); ВНИИ зерновых культур (г.Зерноград, Ростовская область) для использования в качестве донорного в селекционных программах на устойчивость риса к пи- рикуляриозу. Генетическая плазма отечественных сортов пополнена эффектив- ными генами устойчивости к этому, самому вредоносному во всех рисосеющих регионах мира, заболеванию риса.

База данных, содержащая данные об аллельном разнообразии 21-го ми- кросателлитного локуса ДНК образцов российской государственной коллекции Magnoporthe grisea (Herbert) Barr – возбудителя пирикуляриоза риса, передана держателю коллекции, отделу микологии и иммунитета ВНИИ фитопатологии (п. Большие Вяземы, Московская область). Она, несомненно, внесла свой вклад в изучение мирового биоразнообразия паразита. Генетическая паспортизация коллекционных изолятов необходима, кроме того, для защиты авторских прав держателей коллекций.

Разработанная автором методическая схема контроля краснозерной при- меси в питомниках размножения (первичные звенья семеноводства) риса на основе созданного ДНК-маркера гена красной окраски перикарпа риса Rc, дела- ющая возможной раннюю диагностику (до появления метелок) краснозерных форм с их последующей элиминацией из питомников размножения, использу- ется отделом семеноводства и семеноведения ВНИИ риса, что повышает на- дежность контроля.

Оптимизированная методическая схема контроля гибридности партий се- мян трех простых гибридов подсолнечника на основе ДНК (микросателлитно- го) анализа, используется компанией «Агроплазма», оригинатором гибридов, для оценки генетической чистоты производимых коммерческих партий гибрид- ных семян вне зависимости от сезона вегетации подсолнечника, а также для це- лей внутреннего контроля качества используемых для создания простых гибри- дов родительских линий.

Созданная база данных, содержащая информацию о полиморфизме ДНК (микросателлитных)  локусов  районированных  сортов  риса  селекции  ВНИИ риса, а также коллекционных сортообразцов, передана в лабораторию исходно- го материала института для использования в селекционном процессе, для более эффективного подбора родителских пар при гибридизации.

Апробация работы и публикация результатов исследований. Основ- ные результаты исследований ежегодно докладывались на заседаниях методи-

ческих комиссий и Ученого совета ВНИИ риса, а также были представлены на всероссийских и международных конференциях: Eurorice 2001 Symposium. – Краснодар, Россия, 2001; Conference of current European Research on Rice.-Turin, Italy, June 6-8, 2002; Международная научная интернет-конференция. – Ставро- поль, 2002; 3-й съезд Биохимического общества, Тезисы научных докладов. – С.-Петербург, 26.06.2002-01.07.2002; Международная научно-практическая конференция «Трансгенные растения – новое направление в биологической за- щите растений». – Краснодар, 2002; Научное обеспечение агропромышленного комплекса: материалы 5-й региональной науч.– практ. конференции молодых ученых 18-19 декабря 2003 г. – КубГАУ. – Краснодар, 2003; Международная научно-практическая конференция «Биологическая защита растений – основа стабилизации агроэкосистем». – Краснодар, 2004; Всероссийская научная кон- ференция молодых ученых и студентов «Современное состояние и приоритеты развития фундаментальных наук в регионах». – Анапа, 2004; The international conference «Challenges and opportunities for sustainable rice-based production sys- tems». – Turin, Italy, 2004; 6-й Международный симпозиум «Новые и нетради- ционные растения и перспективы их использования». – Москва, Пущино, 2005; Международная научно-практическая конференция «Новации и эффективность производственных  процессов  в  виноградарстве  и  виноделии».  –  Краснодар,

2005; Всероссийская научно-практическая конференция «Развитие инновацион- ных процессов в рисоводстве – базовый принцип стабилизации отрасли». – Краснодар, 2005; Международная научная конференция «Устойчивое произ- водство риса настоящее и перспективы». – Краснодар, 2006; XII International symposium on biological control of weeds. – France, 22-27 April, 2007; Annual Meeting of the Phytopathological Society. – USA, 2007; 5-й Московский междуна- родный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития», 16-20 марта, 2009; Международная научно-практическая конференция «Селекция сортов риса, устойчивых к абиотическим и биотическим стрессам, для стран умеренного климата и Центральной Азии». – Краснодар, 2009; XVII междуна- родный симпозиум «Нетрадиционное растениеводство. Селекция. Охрана при- роды. Эниология. Экология и здоровье». – Алушта, 2008; Международная науч- но-практическая конференция «Селекция сортов риса, устойчивых к абиотиче- ским и биотическим стрессам, для стран умеренного климата и Центральной Азии». – Краснодар, 2009; Annual Meeting of the Phytopathological Society. – USA, August 7-11, 2010.

По материалам докторской диссертации опубликовано 63 работы, из них:

14 статей в изданиях, рекомендованных ВАК РФ, монография и 5 авторских свидетельств на гибриды подсолнечника.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 260 стр. основного текста, включает 27 таблиц, 66 рисунков; состоит из введения, обзо- ра литературы, материалов и методов исследования, результатов и обсуждения, выводов, рекомендаций для практической селекции и семеноводства, списка литературы, включающего 68 отечественных и 231 зарубежных источников и 3 приложений.

Личный вклад автора. Экспериментальные результаты получены авто- ром лично и совместно с коллегами из ВНИИ зерновых культур им. И.Г. Кали- ненко (г. Зерноград, Ростовская область); из ВНИИФ (п. Большие Вяземы, Мо- сковская обл.); из С.-Петербургского госуниверситета (г. С.-Петербург), а также с аспирантами, работавшими в лаборатории биотехнологии и молекулярной биологии ВНИИ риса (г.Краснодар) под руководством диссертанта. Соискате- лю принадлежат разработка программ исследований, схемы основных экспери- ментов, участие в экспериментальной работе и теоретическое обобщение полу- ченных результатов. Доля личного участия в публикациях, выполненных в со- авторстве, пропорциональна числу соавторов.

Автор выражает большую благодарность ведущему научному сотруднику отдела микологии и иммунитета ВНИИФ Т.М. Коломиец; сотрудникам лабора- тории клеточной и генной инженерии растений биолого-почвенного факультета С.-Петербургского госуниверситета Т.В.Матвеевой и Д.И. Богомазу; заведую- щему лабораторией селекции, семеноводства и технологии возделывания риса ВНИИ зерновых культур им. И.Г. Калиненко (г. Зерноград, Ростовская область) П.И. Костылеву за неоценимую методическую помошь в постановке экспери- ментов и обсуждении их результатов; аспирантам диссертанта, И.И.Супруну, Е.Т.Ильницкой, С.В.Волковой, Ю.А.Мягких, С.В.Токмакову, которые принима- ли участие в экспериментальных работах.

Особую признательность автор выражает Г.Л. Зеленскому, заведующему кафедрой генетики и селекции Кубанского аграрного госуниверситета; Н.И. Бенко, директору ООО «Агроплазма», за предоставленный селекционный рас- тительный материал для проведения исследований; а также старшему препода- вателю кафедры биологии и экологии Кубанского государственного универси- тета Д. П. Кассанелли за участие в экспедициционных поездках для сбора рас- тительного материала и помощь в идентификации изучаемых видов растений.