9.5. генетические исследования способности к обучению

Методы анализа. Как известно, классический менделевский генети­ческий анализ рассматривает признаки, которые находятся под влия­нием одного, двух, реже трех генов. Это так называемое моно- или дигенное (т.е. олигогенное) наследование. В подобных случаях получа­ющиеся в результате скрещивания фенотипы (в нашем случае — груп­пы животных, обнаруживающих четкие различия в поведении) раз­деляются на небольшое число дискретных классов. К категории таких «менделирующих» генов (т.е. генов, распределение которых в потом­стве четко соответствует законам Менделя) относятся, например, гены, влияющие на обмен веществ. В очень многих случаях их плейотропные эффекты затрагивают поведение.

Как известно, влияние генов на фенотипические признаки может быть и непосредственным, и опосредованным, т.е. достаточно «дале­ким». Например, первичная структура белка есть непосредственное отражение последовательности нуклеотидов в данном гене. Другие признаки, более сильно отдаленные от первичного действия гена, как правило, испытывают влияние других генетических элементов. Рассмотрим случай, когда признак отдален от первичного эффекта гена несколькими «ярусами» биохимических процессов. Эти биохими­ческие процессы, как правило, влияют не только на интересующий нас признак, но и на многие другие. В подобных случаях этот ген может обнаруживать влияние не только на исследуемый признак, но и на другие стороны строения и жизнедеятельности организма. Это яв­ление называется плейотропией. Описано множество генов со слож­ными плейотропными эффектами.

Широко известны многочисленные плейотропные эффекты му­тации альбинизма, обнаруживающиеся не только у лабораторных мышей и крыс, но и многих других видов животных и даже человека. Альбинизм (отсутствие пигментации в обычно окрашенных тканях и органах) связан с дефектом биохимической системы синтеза пигмен­та меланина. Мутация по гену, ответственному за синтез фермента тирозиназы (у мышей — локус С), изучена достаточно подробно. У жи­вотных-альбиносов отсутствие пигмента в сетчатке ослабляет остроту зрения, вызывает нарушения развития зрительной системы — у таких животных происходит полный (а не частичный, как в норме) пере­крест волокон зрительного нерва. В то же время уровень двигательной активности и ряд других особенностей поведения, не связанных со зре­нием, также бывают изменены.

К плейотропным эффектам следует отнести множественные отклонения от нормы в развитии мозга мышей при неврологических мутациях, например при мутации reeler. Мутация влияет на время формирования волокон радиаль­ной глии (направляющих перемещение — миграцию — будущих нейронов). Аномальное время прорастания глиальных волокон сказывается в дальнейшем на расположении нейронов в мозжечке, новой коре и гиппокампе и сопровождается многочисленными аномалиями поведения и физиологичес­ких процессов у таких мышей. Типичный плейотропный эффект гена — это последствия мутации, вызывающей у человека фенилкетонурию. Первичная причина этого заболевания — отсутствие или низкая активность фермента фенилаланингидроксилазы, превращающей поступающий с пищей фенилаланин в тирозин. Если необходимый для развития тирозин возмещать соответ­ствующей диетой, этот дефект не будет иметь последствий для общей жизне­деятельности. Однако при этом в крови таких больных оказывается повышен­ным уровень фенилаланина. В свою очередь продукты обмена этой аминокислоты попадают в разные органы и ткани, в том числе в мозг, и нарушают их разви­тие. Такое вторичное влияние мутантного гена у человека обнаруживается в задержке развития умственных способностей, особенностях темперамента, изменении пигментации волос.

Драматическими примерами сложных плейотропных влияний одиночных генов может служить ряд других мутаций человека. Например, синдром Леш-Нихана связан с дефектом гена, ответственного за синтез гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазы. При этой мутации обнаруживаются тяжелые расстройства — от подагры и заболевания почек до аномального поведения. Дети, пораженные этим заболеванием, обладают сниженным интеллектом и склонны к «самоистязанию», повреждая себе (часто необратимо) губы и пальцы. Характерно, что они испытывают при этом страдания, поскольку болевая чувствительность у них не изменена (см.: Эрман, Парсонс, 1984; Фогель, Мотульский, 1990).

В то же время огромное большинство признаков поведения отли­чаются плавной, непрерывной (недискретной) изменчивостью, ко­торая связана с работой значительного числа генов (так называемые континуальные признаки). В таких случаях генетическое исследование начинается с анализа «состава» изменчивости.

Специальные биометрические методы позволяют определить, ка­кая доля общей изменчивости приходится соответственно на генети­ческий и средовой компоненты, а также на эффекты взаимодействия генетических и средовых факторов (Мазер и Джинкс, 1985 и др.). В при­менении к генетическим исследованиям поведения примеры таких расчетов и пояснения к ним можно найти в руководстве Эрман и Парсонса (1984).

Селекция крыс на способность к обучению. Первый успешный экс­перимент по селекции лабораторных крыс на способность к обучению был проведен американским исследователем Р. Трайоном (Тryon, 1940). Он проводил селекцию крыс на большую и меньшую успешность обу­чения животных в сложном лабиринте. Для получения каждого следую­щего поколения в скрещивание брали животных, давших самые высо­кие («умная» линия) и самые низкие («глупая» линия) показатели обучаемости. Критерием успешности обучения было число ошибок (за­ходов в тупиковые отсеки лабиринта). Созданные Трайоном линии крыс, действительно различающиеся по способности к ассоциативному обу­чению, продолжают существовать и исследоваться поныне. Это означа­ет, что возникшие в результате селекции различия в поведении со­хранились при последующем разведении этих животных без селекции в течение многих десятилетий (т.е. теперь уже в сотнях поколений).

Эксперимент Трайона показал, что способность к обучению, точ­нее те физиологические и/или морфологические различия в ЦНС крыс, которые обеспечивают высокую или низкую способность к обучению, имеют генетическую основу.

Более подробное исследование поведения и физиологии крыс трай-оновских линий продемонстрировало практически все трудности, под­стерегающие исследователя на этом пути. К числу таких трудностей от­носится проблема выбора признака для анализа. Число ошибочных ре­акций как показатель научения крыс в этом эксперименте нельзя назвать удачным, поскольку на путь животного в лабиринте и на заходы его в тупики, помимо способности к обучению, могут влиять и уровень стра­ха, и тенденция бегать около стенок и т.п. Кроме того, селекция на высокие или низкие величины какого-либо признака поведения мо­жет сопровождаться появлением различий и по другим признакам. Эти «другие» признаки могут быть причинно связанными с исходно выб­ранным для селекции, но могут быть результатом и случайной их ас­социации. Подобные проблемы могут обнаружиться при любом се­лекционном эксперименте, связанном с физиологическими призна­ками и поведением, и при планировании подобных исследований следует учитывать возможность получения таких результатов.

При отборе животных из небольшой исходной выборки в две «про­тивоположные» группы могут случайно попасть особи, контраст­ные не только по признаку, который был целью селекции, но и по другим, с ним не связанным. Причинную связь таких коррелиро­ванных признаков с поведением, исходно выбранным для селекции на крайние значения, можно выявить в специальных экспериментах.

Для этого существуют два основных приема:

можно проанализировать, сохраняется ли такая корреляция у гибридов второго (и последующих) поколений между пред­ставителями селектированных линий; если ассоциация сохра­няется достоверно, следовательно, оба признака причинно свя­заны друг с другом, т.е. имеют общие физиологические меха­низмы (или же соответствующие гены расположены на соседних участках хромосомы); если же ассоциация случайна, то у гиб­ридов корреляции признаков не обнаружится;

можно провести селекционный эксперимент повторно: если у обоих признаков имеется общая физиологическая основа, то у новых селектированных линий корреляция появится снова, и наоборот.

Для крыс трайоновских линий повторного селекционного экспе­римента не проводилось ни автором, ни последующими иследователями, но количество коррелированных признаков, выявленных при подробном сравнении их поведения, оказалось очень велико.

Тестирование трайоновских крыс в лабиринтах других конструкций по­казало, что исходные межлинейные различия сохраняются не всегда. Напри­мер, крысы «умной» линии (ТМВ — Tryon maze bright) обучались существен­но лучше и в исходном 17-тупиковом лабиринте, и в более простом, 14-тупиковом. В то же время при обучении в 16- и 6-тупиковых лабиринтах показатели этой линии были не выше, чем у «тупой» линии (TMD — Tryon maze dull). В дальнейшем было показано, что ТМВ лучше обучались реакции активного избегания в челночной камере, где, спасаясь от удара тока крысы должны были научиться по сигналу переходить из одного отделения камеры в другое (см. гл. 3).

Более высокие показатели обучаемости крыс «умной» линии в тестах, где использовали разные типы подкрепления — пищевое (лабиринт) и болевое (челночная камера), — послужили основа­нием для вывода о действительном существовании межлинейных различий в способности к ассоциативному обучению.

Однако на самом деле картина межлинейных различий оказалась более сложной. Так, не в пример обучению реакции избегания тока в челночной камере, в тесте, когда для избегания удара тока надо было выпрыгивать из камеры, крысы «тупой» линии обучались лучше. Это может означать, что в эксперименте Трайона отбор животных произ­водился (неосознанно, разумеется) не только на способность к обу­чению, но и на какие-то особенности поведения, связанные с лаби­ринтом данной конфигурации. В дальнейшем было обнаружено, что у ТМВ пищевая мотивация была выше, чем у TMD, а оборонитель­ная — слабее и они меньше, чем «тупые», отвлекались при выполне­нии навыка. В то же время крысы линии TMD были более пугливы и сильнее реагировали на манипуляции дверцами лабиринта.

В настоящее время исследователи приходят к выводу, что крысы линии ТМВ лучше решают тесты, связанные с ориентацией в про­странстве, тогда как TMD — успешнее обучаются при использова­нии зрительных раздражителей. Можно полагать, что отбор на раз­ную степень успеха обучения в лабиринте способствовал формиро­ванию генотипов, при которых особенности процесса восприятия, параметры пространственной памяти, мотивация и другие фенотипические признаки оказались в одном случае оптимальными, а в другом — субоптимальными для выполнения данной реакции.

Генетические исследования условной реакции активного избегания.

Активное избегание удара электрического тока в челночной камере (см. гл. 3)— это четкий тест на обучаемость у лабораторных грызунов, показатели которого легко измерить. Он достаточно унифицирован и его результаты, полученные в разных лабораториях, легко сопоставить друг с другом. Поскольку в качестве условного раздражителя можно выбрать звук, то тест позволяет включать в сравнение и животных-аль­биносов, не опасаясь, что свойственная им низкая острота зрения по­влияет на.успешность выполнения навыка.

В начале 60-х годов на основе популяции крыс Вистар итальянс­кий исследователь Дж. Биньями начал селекцию на высокую и низ­кую способность крыс к обучению реакции активного избегания в челночной камере. Уже через несколько лет между селектированными линиями существовали достоверные различия в обучаемости: линии были сформированы. Они получили название Римских (Roman High Avoidance, RHA, Roman Low Avoidance, RLA). С начала 70-х годов селекция и разведе­ние этих крыс проводились независимо в нескольких лабораториях раз­ных стран (Driscoll, Battig, 1982; Femandez-Teruel et al., 1997).

Исследование крыс Римских линий с помощью практически всех существующих методик оценки поведения дало основание считать, что наиболее сильные межлинейные различия у RHA и RLA связаны с эмо­циональностью и разным типом реакции крыс двух линий на стрессоры.

Эти линии тем не менее все же различаются и по способности к ассоциативному обучению как таковой.

В 70-е годы путем селекции были созданы еще две линии крыс — Сиракузские (Syracuse High Avoidance, SHA, Syracuse Low Avoidance, SLA). Они, как и Римские линии, достоверно различались по скорости усво­ения реакции активного избегания, но (в отличие от Римских), не раз­личались по уровню двигательной активности. Исходной популяцией для этой селекционной работы послужили крысы Лонг-Иване. В настоя­щее время крысы хорошо обучающейся линии SHA дают примерно 40 реакций избегания в 60 предьявлениях теста, тогда как SLA — ни одной. У плохо обучающейся линии SLA было мало межсигнальных реакций, однако скорость выполнения реакций избавления (т.е. реакции на вклю­чение собственно болевого стимула — электрического тока) у них не отличалась от линии SHA. Иными словами, межлинейные различия об­наруживались в «готовности» к выполнению перехода из одной полови­ны камеры в другую, но не затрагивали реакции на боль. В тесте «откры­того поля» у Сиракузских, так же как у Римских линий, различался уровень возбудимости вегетативной нервной системы. Речь идет о так называемой «эмоциональности» крыс, которая оценивается по числу болюсов дефекации при помещении животного в новую, слегка пугаю­щую обстановку теста «открытого поля». SLA, так же как и RLA, оказа­лись более «эмоциональными», т.е. испуг у них был сильнее.

Возможно, что менее эффективное обучение реакции избега­ния, общее для линий RLA и SLA, имеет одну причину — повышенную пугливость этих животных, которая препятствует образова­нию ассоциации между условным сигналом и реакцией животного.

Различия в процессах обучения и памяти в связи с генетической изменчивостью строения мозга. В соответствии с традиционно приня­той в нейрофизиологии логикой исследований функциональную роль того или иного отдела мозга в формировании поведения обычно ана­лизировали путем оценки последствий его разрушения, а также элек­трической и/или фармакологической стимуляции.

К началу 70-х годов считалось установленным, что одна из функ­ций гиппокампа (рис. 9.2А) — мощное модулирующее влияние на процессы обучения, в частности торможение инструментальных ус-ловнорефлекторных реакций (Виноградова, 1975).

Американские исследователи Р. и Ц. Ваймеры и Т. Родерик выпол­нили исследование, в котором анализировалась роль генотипических особенностей в обеспечении функции гиппокампа. Способность мы­шей генетически гетерогенной популяции к обучению пассивной ре­акции избегания удара электрического тока (при однократном его применении) авторы сопоставили с общим объемом гиппокампа, который определяли после окончания экспериментов. Для этого на срезах мозга каждого животного, прошедшего тест на обучение, оп­ределили площадь, занимаемую гиппокампом, а затем в соответствии с существующими морфометрическими правилами вычислили его суммарный объем (Wimer et al., 1971).

Сопоставление результатов опытов с поведением и данными подсчетов показало, что чем больше был размер гиппокампа, тем эффективнее данное животное обучалось пассивному избеганию.

Коэффициенты корреляции достоверно свидетельствовали о том, что размер гиппокампа (а возможно, какого-то из его отделов) опре­деляет особенности выполнения выученного навыка (т.е. обучения как такового). Очень важно, что такая корреляция была получена в экспе­рименте без применения инвазивных методов, т.е. без прямого нару­шения целостности мозга. Кроме того, поскольку исследуемая попу­ляция мышей была генетически высокогетерогенной, можно было предположить, что обнаруженная скореллированная изменчивость обо­их признаков (размер гиппокампа и эффективность научения) по край­ней мере частично имела генетическую основу.

Морфометрические исследования (т.е. количественная оценка об­щих размеров) ряда отделов гиппокампа у мышей и крыс разных генотипов подтвердили существование достоверных межлинейных различий. Первоначально для анализа была выбрана условная реакция избегания в челночной камере (см. 3.2). Индивидуальную изменчи­вость темпов обучения этой реакции исследователи рассматривали как зависимую переменную (см.: Lipp etal., 1989; Schwegler, Lipp, 1995). В качестве независимой взяли вариабельность зоны окончания мшис-

Рис. 9.2. Роль размера проекционной зоны iipMF гиппокампа мышей в формировании пространственного навыка поиска пищи в радиаль­ном лабиринте.

А - схема строения гиппокампа; толстой стрелкой показана зона окончания iipMF; Б - слева: схема последовательных посещений мышью лучей радиаль­ного лабиринта, содержащих приманку, с небольшим числом повторных, ошибочных заходов; справа: график, отражающий зависимость между чис­лом ошибочных заходов на 5-й день теста у мышей ряда инбредных линий, различающихся (нижняя схема) по относительному размеру проекции iipMF, который отложен по оси абсцисс графика (по: Lipp, Wolfer, 1995).

тых волокон, аксонов гранулярных клеток зубчатой фасции гиппокампа на базальных дендритах пирамидных нейронов поля САЗ (рис. 9.2А). Мши­стые волокна оканчиваются в пирамидном слое поля САЗ крупными синаптическими бляшками. Зоны их окончаний формируют два чет­ких синаптических поля, т.е. две области проекции. Одна из них рас­полагается непосредственно над пирамидными нейронами поля САЗ и называется супрапирамидным слоем. Вторая, меньшая по объему, рас­полагается ниже или внутри слоя пирамидных клеток. Эта область назы­вается слоем интра- и инфрапирамидных мшистых волокон, iipMF. Избирательная окраска именно этой структуры (метод Тимма) позволяет с высокой точностью определить ее размеры. У крыс Римских линий (см. выше), резко различающихся по скорости формирования навыка избегания удара тока, была выявлена отрицательная корреляция между площадью проекции мшистых волокон iipMF и способностью к обуче­нию этой реакции. У мышей ряда инбредных линий, в том числе ли­ний DBA/2J, СЗН/Не (размеры их зон проекций мшистых волокон схе­матически представлены на рис. 9.2Б справа), также была обнаружена сильная и высокодостоверная отрицательная (-0,92) корреляция пло­щади iipMF и показателей обучения в челночной камере. У гибридов второго поколения от скрещивания этих линий корреляция может сохраниться только в случае, если ассоциация обоих признаков не­случайна. В эксперименте индивидуальная корреляция способности к обучению и площади iipMF у гибридов оказалась высокой.

На большом и разнообразном экспериментальном материале было показано, что крысы и мыши тем лучше обучаются данному навыку, чем меньше у них площадь iipMF.

Напомним, что выработка навыка избегания наказания в челноч­ной камере — это типично лабораторный тест, аналога которому в естественном поведении грызунов практически нет. Его отрицатель­ная корреляция с размером определенного отдела мозга еще ничего не говорит о функциональной значимости этой структуры. В этом от­ношении значительно больший интерес представляло исследование таких же корреляций в тестах, более адекватных экологической спе­циализации крыс и мышей.

Для выяснения участия генотипа в формировании когнитивных спо­собностей животных более информативными оказались данные о кор­реляции размера iipMF с успешностью формирования навыка обучения в радиальном лабиринте (см. 3.4.2.1), которое требует формирования про­странственных представлений (формирования «мысленного плана» ла­биринта, см. 3.4). В таких экспериментах была обнаружена достоверная положительная корреляция размера iipMF и обучаемости мышей про­странственному навыку (Schwegler, Lipp, 1995). На рис. 9.2Б слева по­казана схема перемещения мыши по радиальному лабиринту при реше­нии задачи, а также график зависимости успешности выполнения на­выка от размеров данной зоны синаптических окончаний. Под графиком схематически изображены размеры проекций мшистых волокон у мы­шей двух линий (см. выше). Выполнение теста Морриса (обучение в водном лабиринте, см. 3.4.2.2), точнее, «прочность» сформированной пространственной памяти, положительно коррелирует с размером iipMF (Schwegler, Lipp, 1995).

Тесты на способность к обучению на основе формирования представления о пространстве и о своем положении в нем живот­ные усваивают тем успешнее, чем больше у них размер проекции мшистых волокон гранулярных клеток на базальных дендритах пирамидных нейронов поля САЗ гиппокампа.

Были проанализированы корреляции успешности выполнения «про­странственных» и непространственных тестов с размерами и других об­ластей гиппокампа (не только с iipMF), однако таких фенотипических корреляций с толщиной отдельных слоев гиппокампа в его разных уча­стках, т.е. с числом клеточных элементов и мощностью дендритных ство­лов пирамидных клеток, не обнаружено (Schwegler, Lipp, 1995).

Итак, обнаруженные нейроморфологические и поведенческие корреляции дают основание утверждать, что данная область си­наптических окончаний (соединяющая гиппокамп с областью энторинальной коры и с новой корой) играет принципиально важ­ную, ключевую роль в осуществлении и/или модуляции процес­сов обучения разных типов.

Эти результаты были получены благодаря широкому использова­нию в лабораторных тестах генетически охарактеризованных живот­ных, а также применению основных методов анализа генетических различий. В настоящее время исследование когнитивных способностей животных в этом тесте является одним из ведущих подходов в оценке особенностей поведения трансгенных животных и мышей-нокаутов. Детальнее с этими вопросами можно познакомиться в работе Lipp, Wolfer (1998), а также в материалах симпозиума «Behavioral Phenotyping of Mouse Mutants» (Cologne, 2000).

Использование трансгенных мышей при исследовании роли генотипа в процессах обучения и памяти. Методы генной инженерии и молеку­лярной биологии сделали возможным получение так называемых транс­генных животных. Как говорилось выше, такие исследования — это реализация подхода «от гена к поведению». Как правило, это физиоло­гический и биохимический анализ, а также исследование поведения искусственных мутантов, у которых был видоизменен определенный участок генома. Для их создания в геном животного (в настоящее время используются почти исключительно мыши) вводится новый генети­ческий материал. Таким материалом может быть или участок ДНК, ко­дирующий измененный ген, уже имеющийся у реципиента, ген от жи­вотного другого вида (например, крысы), либо генетическая конструк­ция, которая выключает какой-либо из генов реципиента (см.: Льюин, 1987; Jones, Mormede, 1999).

Выделенный фрагмент ДНК вводится в геном на ранней стадии эмбри­онального развития. С методами введения можно ознакомиться в специальных руководствах. В результате соответствующих манипуляции формируются так называемые химерные животные. Нередко оказывается, что гомозиготные по новой мутации особи (мыши с обоими мутантными аллеями) нежизнеспо­собны, и ее удается поддерживать только в гетерозиготном состоянии. Однако чаще всего популяция трансгенных мышей представляет собой смесь из жи­вотных дикого типа (гомозиготных по нормальному аллелю гена), гетерозиготных особей (имеющих один нормальный и один мутантный аллель) и го­мозиготных по мутантному аллелю. Генотип каждого животного можно опре­делить методом полимеразной цепной реакции или иным методом, подвергнув анализу небольшой кусочек ткани животного (обычно для этого отрезают кончик хвоста). Иногда гомозиготные носители нового гена внешне отлича­ются от нормальных собратьев.

Специальные молекулярно-биологические приемы должны обеспечить до­статочно надежную экспрессию новой ДНК в геноме реципиента. В против­ном случае введенный в геном фрагмент может сохраняться в латентном виде, не обнаруживая себя.

Наиболее часто эксперименты по получению искусственных мутан­тов или животных-нокаутов проводятся с целью выяснить роль в орга­низме того или иного белка, чаще всего обладающего ферментативной активностью, или белков-рецепторов клеточной поверхности. При ра­боте с нейрогенами, т.е. с генами, которые экспрессируются («работа­ют») в мозге, наибольшее число исследований проведено с выключе­нием белков-рецепторов, избирательно связывающихся с нейромедиа-торами и другими молекулами, влияющими на режим синаптической передачи в нейронах разных структур мозга. В настоящее время насчиты­вается много сотен мышей-нокаутов с инактивированными генами раз­ных функциональных групп, и их число продолжает расти.

Рассмотрим результаты наиболее известных исследований, в ко­торых оценивали влияние выключения нейрогенов на процессы обу­чения и памяти.

Экспериментальные схемы обучения, которые используются для тестирования запоминания у лабораторных мышей и крыс, позволя­ют с большой надежностью проанализировать влияние какого-либо фактора на краткосрочную или долгосрочную память и на процесс собственно усвоения навыка. В качестве «навыка» обычно выбирают выполнение животным простой двигательной реакции или, наобо­рот, невыполнение (торможение) такой реакции. В целях большей четкости эксперимент строят таким образом, чтобы усвоение навыка происходило при единственном сочетании условного и безусловного раздражителей. Достаточно популярны в таких исследованиях оценка синаптической проводимости гиппокампа электрофизиологическими методами и формирования пространственного навыка в тесте Морриса.

Долговременная посттетаническая потенциация. Важным модельным объектом для изучения процесса обучения стала так называемая долго­временная посттетаническая потенциация (long term potentiation, LTP).

LTP — это одно из проявлений синаптической пластичности (т.е. изменения проводимости синапсов), происходящее в результате дли­тельной бомбардировки слоя пирамидных нейронов гиппокампа (об­ласть СА1) электрическим раздражением аксонов, оканчивающих­ся на этих нейронах (т.е. искусственным путем).

Подобные эксперименты в большинстве случаев проводятся на так называемых переживающих срезах гиппокампа, помещенных в специаль­ную питательную среду, т.е. in vitro. В результате потенциации клетки гиппокампа начинают активно реагировать на раздражения, неэффек­тивные до нанесения электрической стимуляции. Для этого процесса (как и для разных форм обучения) необходим целый ряд условий:

активация так называемых NMDA-рецепторов (т.е. белковых мо­лекул, расположенных в мембране нейронов и изменяющих ее проводимость при соединении с N-метил-D-аспартатом, — ве­ществом, имитирующим эффект нейромедиатора);

повышение внутриклеточного уровня ионов кальция (Са2+), что в свою очередь обеспечивается определенным каскадом событий с участием системы так называемых вторичных посредников (цик­лического аденозинмонофосфата — С-АМР и др.);

участие ряда ключевых ферментов (протеинкиназа- С, Сa2+-калмодулинзависимая протеинкиназа II — СаМКII и тирозинкиназа).

Течение LTP в гиппокампе мышей-нокаутов с выключенны­ми генами, кодирующими такие белки, сильно видоизменялось, однако она полностью не исчезала. Одновременно у этих мышей было нарушено формирование пространственного навыка в тесте Морриса.

Гистологическое исследование гиппокампа показало у них нару­шения в расположении гранулярных клеток зубчатой фасции, т.е. тех нейронов, аксоны которых образуют iipMF.

Мыши с искусственной мутацией гена СаМКII нормально обу­чались навыку отыскания безопасного убежища при наличии сиг­нальных раздражителей, но не могли усвоить этот навык, когда для этого требовалось формирование пространственных представ­лений, т.е. «пространственной карты» (см. 3.4).

К тому же у них при ритмическом электрическом раздражении гиппо­кампа с частотой 5—10 в сек (т.е. с частотой тета-ритма, как правило, присут­ствующего в суммарной электрической активности гиппокампа при исследо­вательском поведении) LTP не наступала, в то время как при высокочастот­ном раздражении она развивалась нормально. В норме у мышей могут развиваться обе формы LTP.

Можно проанализировать, как сказывается на процессе обучения противоположное генетическое изменение — «сверхэкспрессия» како­го-либо гена. Специальными приемами можно усилить работу гена не во всем мозге, а только в определенных его участках. Такие вполне жизнеспособные животные демонстрируют поразительные видоизме­нения поведения (Mayford et al., 1995).

Сверхпродукция белка NMDA-рецептора типа 2В в переднем мозге мутантных мышей сопровождалась резким усилением способности к обучению в ряде тестов (так же как и усилением LTP).

Мутантные мыши превосходили контрольных по усвоению навыка «застывания» (freezing response) при тестировании после однократно­го применения удара электрического тока, и у них было более прочное запоминание этой условной реакции. Обучение в тесте Морриса у этих мышей также было более эффективным. Данные наблюдения позволя­ют сделать вывод, важный для нейрофизиологии обучения: изменение эффективности NMDA-проводимости (и видимо, изменение интенсивности последующих процессов в нейроне) одинаково влияет на формирование разных навыков и, следовательно, представляет собой одно из универсальных звеньев в про­цессе обучения.

Известно, что формирование памяти — это ступенчатый процесс. На животных разного филогенетического уровня показано, что в этом процессе выделяются по меньшей мере две четкие стадии:

* краткосрочная память, которая не страдает от введения веществ, подавляющих синтез белка или образование молекул РНК;

* долгосрочная память — ее формирование может быть блокиро­вано введением этих веществ.

Переход от краткосрочной памяти к долгосрочной — консолида­ция — сопровождается активацией генетического аппарата или экспрес­сией новых генов, которые до этого были неактивны (репрессированы).

Считается установленным, что долговременная память связана с изменениями в структуре синоптических белков. Такие изменения осу­ществляются в результате целого каскада событий, принципиальным моментом которых является фосфорилирование, т.е. присоединение радикала неорганического фосфата к целому ряду белков. Этот биохи­мический процесс напрямую связан с изменениями в синапсах при их активации, он универсален и, как говорилось выше, принципи­ально сходен у животных разного уровня эволюционного развития. Выключение из каскада одного из его звеньев (путем «нокаута» соот­ветствующего гена или, наоборот, усиления его работы) дает воз­можность оценить изменения в процессах собственно «следа» памяти.

Одним из наиболее известных примеров таких изменений у мы­шей-нокаутов является выключение гена, кодирующего белок CREB (Bourchaladze et al., 1994). CREB (c-AMP response element binding protein) относится к так называемым факторам транскрипции, или регуляторным белкам.

Мыши-нокауты по гену CREB достаточно эффективно обучались и хорошо запоминали навык в интервалах «работы» краткосроч­ной памяти (30 и 60 мин после сеанса обучения). Если же сохранение навыка тестировали в сроки, когда должна «работать» долгосрочная память (через 2 ч), то его воспроизведение было сильно нарушено.

Кроме этого, долговременная потенциация (LTP) у мышей с от­сутствием гена, кодирующего белок CREB, развивалась аномально в тех же временных пределах. Через 2 ч после воздействия, вызывающего LTP, в срезах гиппокампа таких животных все ее проявления уже от­сутствуют, тогда как в срезах мозга нормальных мышей сохраняются.

Совокупность данных, полученных на животных разного уровня развития, позволяет в настоящее время считать, что экспрессия транс­крипционного фактора CREB, который активирует гены, прямо свя­занные с формированием памяти, и ряда других генетических эле­ментов является важным этапом записи следа памяти в мозге.